如何获得目的基因分子生物学技术

对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用，称这种基因为目的基因。在已知目的基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下，目前获得目的基因的方法主要有以下几种：基因人工化学合成法，基因组文库法、cDNA文库法和PCR法等。图5-9基因文库基因组文库法是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。一个基因文库中应包含的克隆数目与该生物的基因组的大小和被克隆DNA片段的长度有关。

理论教育 2023-11-04

重组DNA：分子生物学技术突破

重组DNA技术研究的内容主要包括以下几个方面。应用重组DNA技术可以克隆和扩增某些原核生物和真核生物的基因，从而可以进一步研究它们的结构和功能。由此可见，获取目的基因也同样是重组DNA技术研究的重要内容。重组DNA技术研究的基本任务是开发人民需要的基因产物，这样的基因叫做目的基因。在基因诊断领域，利用重组DNA技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷，因而比传统的诊断手段更加可靠。

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蛋白质沉淀技术：提高蛋白质收率，减少中性盐消耗

蛋白质分子从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀，蛋白质溶液是亲水溶胶，变性后的蛋白质较易于沉淀。这样不仅提高了蛋白质的收率，而且所消耗的中性盐较少，同时还可以减弱共沉淀作用。根据不同蛋白质有不同的等电点这一特性，依次改变蛋白质溶液的pH值，可分步将不同的蛋白质沉淀析出，从而达到分离纯化的目的。

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RNA提取与cDNA合成方法-分子生物学技术

自首例cDNA克隆问世以来，已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法，并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。

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选择和修饰克隆载体的方法-分子生物学技术

用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等，通常选用克隆载体；为了在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物而选用表达载体。根据宿主细胞的不同，表达载体可以分为原核细胞表达载体、酵母细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体和昆虫细胞表达载体等，它们分别携带相应宿主细胞表达目的基因所需要的各种元件和筛选标志。表达载体的选择则比较复杂，有时需要更换不同的载体以获得最佳表达效率。

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蛋白质浓缩与脱盐方法及注意事项

此方法适于生物大分子尤其是蛋白质的浓缩或脱盐，是近年来发展起来的新方法，并具有很多优点。操作时应注意缓冲液的pH不要接近或等于蛋白质的等电点。沉淀法不仅可以用于蛋白质的粗分离，同样也可用于蛋白质的浓缩。冷冻干燥后，残余的水份可影响到蛋白质的活性。利用这一性质可以从破碎了的细胞碎片中分离、纯化蛋白质，浓缩蛋白质也可用该方法。

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全基因组测序技术-疾病研究的革命性进步

测序技术是基因组学研究的基础和核心技术，是对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定。（三）全基因组测序全基因组测序技术的出现对医学领域来说是一次革命性的进步，已经成为疾病研究、临床诊断中重要的手段。通过全基因组测序获得碱基全序列，便于进行全面、精确的分析，破解其包含的信息，加深对疾病发生机制的了解，有针对性地制定相应的应对办法，目前，主要应用于癌症、传染性疾病和遗传性疾病的致病机理的研究方面。

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大肠杆菌DNA连接酶：关键角色与应用

大肠杆菌DNA连接酶最初是在大肠杆菌细胞中发现的，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色。大肠杆菌DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。在基因工程技术中最常使用的是噬菌体T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶分子是一条多肽链，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。无论是T4 DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

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基因组DNA提取与纯化|分子生物学技术

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用DNA大分子。（一）动物组织提取基因组DNA1.材料哺乳动物新鲜组织。

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肽段氨基酸顺序测定方法-分子生物学技术

②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。利用高效液相色谱，对带有生色基团的氨基酸残基进行分离分析。紧邻的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC进行耦联反应。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。④蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。

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分子生物学技术中的重组体表达及表达策略

核糖体结合位点是表达载体中另一必不可少的元件，原核系统中的RBS亦称为SD序列。多数表达载体中都带有转录终止序列。真核细胞表达载体应该至少具备两项功能：一是能够在原核细胞中进行目的基因的重组和载体的扩增；二是具有真核宿主细胞中表达重组基因所需的各种转录和翻译调控元件。蛋白质的表达方式有多种，分为分泌表达、非分泌表达、融合表达和非融合表达等。在实际工作中，要针对相应的外源基因设计相应的表达策略。

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限制性核酸内切酶：三类及应用

（一）限制性核酸内切酶概述限制性核酸内切酶是能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶，简称为限制性内切酶。根据裂解DNA的方式等方面的差异，通常将限制性核酸内切酶分为三类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。基因工程中常用Ⅱ型，Ⅱ型限制性核酸内切酶可对DNA进行可控制的精确切割。多数限制性内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度低于或高于37℃。

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Southern印记杂交法：分子生物学技术的重要应用

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。（二）实验方法以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。为了有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。

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比较基因组学：发现新基因和功能性SNP的有效手段

比较基因组学分析主要有三个方面：基因组结构、编码区域和非编码区域。人基因组的基因数目大约2.5万个，其中只有一小部分被人们认知，通过比较基因组学可以有效地发现新的基因，如将小鼠的Syntenic区域与人基因组比较发现了H4f5基因。比较基因组学提供了从庞大的基因组中找到功能性的SNP的有效手段，SNP的检测也已实现了自动化，检测效率大大提高，通过比较不同个体和物种的基因组序列，高通量地寻找功能性SNP。

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消毒和灭菌对细胞培养成果的影响

微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因。不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后再打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。

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新基因的分离（RACE）技术在分子生物学中的应用

随着生物技术的不断发展，获取新的基因成为分子生物学研究的重要内容。（一）基本原理经典的RACE技术主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5′和3′端，也叫单边PCR或锚定PCR。Matz等在cDNA合成过程中，利用模板转换效应、PCR抑制效应和降落PCR技术，有效地提高了cDNA末端快速扩增的灵敏度，这种经改进的RACE称为SMART RACE。

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