斜纹夜蛾spli caspase-1基因的克隆

武汉东湖学院生命科学与化学学院　阎　隽　王莹莹

对哺乳动物和果蝇Caspase的研究表明，一些Caspase在凋亡中没有明显的作用，而另一些Caspase在凋亡和非凋亡途径中都有作用。对昆虫Caspase的研究可为可选择途径中Caspase的功能和调控方面的作用提供重要依据，并且在鳞翅目昆虫内鉴别Caspase基因、阐述其功能、揭示Caspase基因在昆虫体内的普遍性具有重要的理论价值。紫外线、芹菜夜蛾核型多角体病毒（sfMNPV）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）都可诱导斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）SL-1细胞凋亡，这说明在SL-1细胞中Caspase表达活性高。本实验根据已报道的鳞翅目昆虫Caspase基因的相关信息设计引物，以SL-1细胞总RNA为模板，利用RT-PCR和cDNA 末端快速扩增技术(RACE)，以期望扩增出SL-1 Caspase基因序列，探讨SL-1 Caspase基因的序列特点。

Caspases 是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。在细胞凋亡中，Caspasse是引起细胞形态学和生物学改变的关键执行者。

迄今已有多种类型的Caspase得到了解析，在草地贪夜蛾（spodoptera frugiperda）中首次发现昆虫Caspase基因，命名为Sf-caspase-1，它与哺乳动物Caspase-3和苍蝇Drice基因类似。除此，在鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）、蝴蝶（Rhopalocera)、莲纹夜蛾（Spodoptera littoralis）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）等分离鉴定的Caspase-1和果蝇效应Caspase有高度同源性，且具有QACRG的五肽活性位点，该活性位点是Caspase 家族的典型结构。

本实验根据已报道的鳞翅目昆虫Caspase基因的相关信息设计引物，以SL-1细胞总RNA为模板，利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)，以期望扩增出SL-1 Caspase基因序列，探讨SL-1 Caspase基因的序列特点，从而为进一步探索该基因在细胞凋亡中的作用和找到与调控Caspase活性有关的蛋白提供重要线索。

一、材料和仪器

1.材料

斜纹夜蛾（Spodoptera litura）SL-1细胞系为本实验室传代保存。反转录酶M-MLV、RNase OUTTM核酸酶抑制剂购于Invitrogen公司；Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；RACE试剂盒为Invitrogen公司SMART RACE试剂盒；其他试剂为国产分析纯；DNA序列的测定由华大基因有限公司完成。

2.实验所用仪器

台式高速冷冻离心机（Sigma公司3K-30、6K-15）、电热恒温培养箱（上海精宏）、PCR仪（MJ Research公司）、凝胶成像系统（Syngene公司）、DYY-4型电泳仪及其电泳槽（北京六一仪器厂）、微量移液器（10ul、100ul、1000ul）、无菌操作台（哈东联）、紫外分光光度计（eppendorf）、全温振荡器（哈东联）、自动蒸汽消毒柜（Gene Company）、SS-325灭菌锅(TOMY SEIKO)。

二、方法

1.总RNA的提取

斜纹夜蛾总RNA的提取采用Trizol试剂，按照说明书进行。提取结束后用紫外分光光度计检测总RNA的浓度并进行逆转录。逆转录引物为Oligo d(T)15。逆转录体系参照Invitrogen公司M-MLV的逆转录酶的说明书进行。

2. caspase基因片段的扩增

通过比对斜纹夜蛾（Spodoptera litura）与草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和莲纹夜蛾（Spodoptera littoralis）的Caspase-1的氨基酸序列，分析表明它们的caspase基因同源性很高，由此设计引物：

（上游）5'- AAA CAT CGT GGT ATG GC -3'

（下游）5'- GAG CCA TCT GTC TCA GTG -3'

全长为419bp

PCR反应

品名　　　　　　　　　体积（ul）　　　　　　终浓度

10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)　　　　　 5　　　　　　1×

dNTP（10Mm）　　　　　　　　　　5　　　　　200umol/L

上游引物　　　　　　　　　　　　1　　　　　0.8umol/L

下游引物　　　　　　　　　　　　1　　　　　0.8umol/L

模板DNA　　　　　　　　　　　　 1　　　　　　1ug

Taq DNA聚合酶　　　　　　　　　 1　　　　　0.5—1ug

双蒸去离子水　　　　　　　　　　　　　　　　　36

总体积　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　50

PCR反应热循环程序

第一步：94℃预变性　　　　　　　　　　　　　　4min

第二步：94℃变性　　　　　　　　　　　　　　　30s

第三步：55℃退火　　　　　　　　　　　　　　　45s

第四步：72℃延伸　　　　　　　　　　　　　　　1min

设置从步骤2到步骤4，共30个循环

第五步：72℃延伸　　　　　　　　　　　　　　　6min

第六步：4℃保温　　　　　　　　　　　　　　　　1h

反应结束后，取5ul PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下观察PCR结果。

3.PCR产物的回收纯化

将实验所得到的目的片段进行凝胶回收，回收方法根据试剂盒（琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒）说明书进行。

4.PCR产物与pGM-T载体的连接、转化(www.daowen.com)

（1）CaCl₂感受态细胞的制备。将载体在冰上融化，短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。

（2）按照表1的内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1︰3—1︰8。

表1　反应体系

（3）轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心，将混合反应液置于22℃—26℃水浴反应1—2h。

（4）转化。常规检测：将得到的白色菌落接种1—5mlLB（含有终浓度为50—100ug/ml的氨苄青霉素）培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用酶切方法鉴定插入片段是否正确。

5.DNA序列测定

随机选择阳性克隆，送交公司测序。DNA的测序由南京金斯瑞生物科技公司完成。

6.cDNA序列生物信息学分析

将测得的cDNA序列,在NCBI的GeneBank中比较其序列同源性。

三、实验结果与分析

1.斜纹夜蛾Sl-1细胞总RNA电泳图（图1）

图1　斜纹夜蛾Sl-1细胞总RNA电泳图

2.RT-PCR产物琼脂糖电泳鉴定

将提取得到的总RNA反转录得到cDNA，作为PCR的模板，根据斜纹夜蛾（Spodoptera litura）与草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和莲纹夜蛾（Spodoptera littoralis）的Caspase-1的氨基酸序列，分析表明它们的caspase基因同源性很高，由此设计引物，（上游）5'- AAA CAT CGT GGT ATG GC -3'，（下游）5'- GAG CCA TCT GTC TCA GTG-3'，全长为419bp，RT-PCR产物如图2所示。

图2　RT-PCR电泳图

3.目的片段的酶切琼脂糖电泳图

将PCR反应产物连接到pGM-T载体上，转化到DH5a感受态细胞中，选取阳性菌落，提取质粒后用单酶切验证，图片中出现两条带，其中一条在3.0kb左右，另一条比500bp略小，说明已经将目的片段插入到载体中，如图3。

图3

4.测出的cDNA序列

将纯化后的片段连接到T-载体上进行测序，全长419，序列结果如下：

AAACATCGTGGTATGGCCATTATTTTCAATCACGAGCATTTCGACATTCACAGTCTGAAGTCGCGTACTGG CACAAATGTAGACAGCGACAACCTTTCCAAAGTTCTTAAAGGTTTGGGATTCAAAGTGACTGTGTTCACTAACTT AAAATCAGAAGAAATCAATAAATATGTCCAGCAGACTGCAGACATGGACCATTCTGACGCTGACTGTTTACTCGT TGCTGTTTTAACCCATGGGGAGCTAGGAATGTTGTATGCCAAAGATACTCATTACAAGCCAGAGAACCTGTGGTA CTACTTTACTGCTGACAAGTGCCCCACTCTGGCTGGAAAACCTAAGCTGTTCTTTATTCAAGCTTGCCAAGGTGA TAAATTGGATGGTGGTGTTACTCTGAGCCGCACTGAGACAGATGGCTC。

5.同源性比对

利用NCBI-Blast软件分别与草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和莲纹夜蛾（Spodoptera littoralis）的caspase基因进行比对，发现其同源率分别为99%和93.6%，初步证明结果正确。

四、结论

Caspases是一组结构上相关的半胱氨酸蛋白酶类，在氨基酸序列、结构和底物特异性上具有相似的特征。未活化的Caspases以酶原形式存在，酶原包含三个结构域，即NH2末端结构(prodomain)、约20kD的大亚基和约10kD的小亚基。不同的Caspases具有不同的剪切活化方式。有文献报道，Caspases酶原至少可以通过3种方式剪切激活：自活化、转活化和非Caspase蛋白酶活化。目前，关于哺乳动物及果蝇的Caspases蛋白酶家族在凋亡中的作用已研究得比较深入，但斜纹夜蛾的相关研究鲜有报道。研究斜纹夜蛾的凋亡基因对于昆虫Caspase家族的功能、调控和相互作用方面的研究，以及对细胞凋亡的分子机制的作用研究有重要作用。

本实验根据已报道的鳞翅目昆虫Caspase基因的相关信息设计引物，以SL-1细胞总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增目的片段，并将目的片段与pGM-T载体连接测序，利用NCBI-Blast软件分别将该序列与草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和莲纹夜蛾（Spodoptera littoralis）的caspase基因进行比对，发现其同源率分别为99%和93.6%，可初步确定结果正确。至此，本实验还只是得到了斜纹夜蛾caspase基因的一部分，还需进一步努力克隆出完整的斜纹夜蛾caspase基因，为此，进一步的实验思路为利用已经得到的部分目的片段设计引物，再利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)，以期望扩增出SL-1 Caspase基因序列，探讨SL-1 Caspase基因的序列特点。

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