图4－3目镜测微尺
Ⅰ．直线式;Ⅱ．网格式

(3)细胞及细胞内含物等的测量:先将目镜测微尺装入目镜内的铁圈上，用镜台测微尺标化。标化时，转动目镜，移动镜台测微尺，使两种量尺的刻度平行，并使它们的一端重合，再找出另一端的重合刻度，分别记录目镜测微尺和镜台测微尺重合范围内的刻度，计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件下所相当的大小(mm)。如用5×目镜和40×物镜，测得目镜测微尺的100格，等于镜台测微尺的50格，即目镜测微尺在这一组合中每格实际长度为5 mm。测量时，以目镜测微尺测量被检物的小格数，乘以每小格的大小(mm)即得。如果用不同倍数的目镜，必须重新标化和计算(见图4－4)。

图4－4目镜测微尺每格实际长度的测定

五、显微镜的保养

1．随时保持清洁

机械部分可用软毛巾擦拭。光学部分的灰尘必须用镜头毛刷拂去，或用吹风机吹去，再用拭镜纸轻擦，切忌用手指或其他粗糙物如纱布等擦拭，以免损坏镜面。

2．做好“四防”工作

(1)防潮:显微镜应放在干燥的地方。如果长期放在潮湿的地方不使用，透镜容易发霉，不仅影响成像质量，还会腐蚀透镜表面，造成透镜损坏，显微镜的金属部分也容易生锈。特别在高温多雨季节，一定要采取防潮措施。不经常使用的显微镜，擦拭干净后，放在镜箱内保存。镜箱内一般都要有一两袋干燥剂，要经常检查干燥剂是否失效。在使用过程中也要注意防潮，特别是临时装片，水分切勿过多。观察时不能倾斜显微镜或倾斜角度过大，以免水分流到显微镜上。万一水分粘在镜身上，要及时擦干。冬季在低温的环境中进行观察时，观察者呼出的水汽会在镜臂上凝聚成水珠，也要及时擦拭干净。

(2)防腐蚀:显微镜不要与腐蚀性的酸类或碱类药物放在一起。观察液体标本时，一般都要盖上盖玻片。若液体中有酸碱或腐蚀性化学物质时，要特别小心，观察完后要立即擦干净镜头和载物台。

(3)防热:显微镜不应在阳光下曝晒，以免造成损坏。

(4)防撞击:搬动显微镜时千万不要碰撞。若遇机械失灵，使用困难时，绝不可强行转动，更不能任意拆修，应立即报告指导教师解决，以免造成损坏扩大。

第二节　植物和生药显微标本的制作技术

显微鉴别是鉴别植物和药材的重要手段。实验中根据材料的自然特性，结合观察和研究的需要，将材料制成适宜的显微标本，选择合适的显微镜，显示材料正确而清晰的结构，获得反映材料真实特征的显微照片，是显微鉴别的重要途径。随着多种切片技术的运用、多功能显微镜的广泛使用及植物显微成像技术的日渐成熟，显微鉴别技术也获得了较快的发展。传统的制片技术和观察方法，因其简便、快速、经济的特点也得到了持续广泛的使用。

植物和生药的显微标本，根据保存时间分为:临时制片和永久制片;根据制作方法分为:活体观察、切片法和非切片法。

一、植物制片方法

在进行显微鉴定时，应首先选择具有代表性的检品，制作显微标本片，然后在显微镜下进行观察。显微标本片根据制作方法和保存的需要，分为:半永久制片、永久制片和临时制片三大类。

半永久制片的封藏介质是半固体，可作暂时性保存;永久制片的封藏介质是固体，可作长期保存，但其制作费时，多用于特殊目的，如供显微摄影和核对标本等应用;临时制片的封藏介质是流动性液体，容易损坏，不耐久藏，但制作简单、迅速，适用于一般观察及进行显微化学反应，在植物和药材鉴定工作中应用最多。

在鉴定工作中，由于观察的目的不同，对不同检品采取的制片方法也不同，又分切片标本片(包括横切片、纵切片，纵切片又包括切向纵切片和径向纵切片)、解离组织标本片、表面标本片、粉末标本片和磨片等。其中横切片多用于观察组织的排列特征;纵切片多用于观察茎、木类生药的某些细胞和组织，如射线的特征;解离组织片用于观察某些细胞的形状，如纤维、石细胞等;表面片多用于观察叶、花、全草、果实和种子等的表面特征，一般取某一部分制片;粉末片多用于观察组织碎片、细胞及后含物或某些生药颗粒的特征;磨片用于坚硬药材，如骨类、贝壳类及矿石的显微特征观察。

根据鉴定工作的需要，可采用徒手制片和机械制片等手段，制备各种显微制片供显微特征的观察和描述。常用的方法有徒手切片制片法、表面制片法、粉末制片法、组织解离制片法、滑走切片法、石蜡切片法。

滑走切片法是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。石蜡切片法是常规制片技术中最为广泛应用的方法，能够切出薄而均匀的连续切片，包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。

1．徒手切片制片法

(1)取材。根类一般取主根中部，长2～3 cm，直径1～1．5 cm，较粗的根或根茎可用分割法，用刀割取所需部分;叶类以及鳞茎和完整的鳞叶，一般取主脉中部带有少量两侧叶肉部分;花类，一般取各部分分别制片;果实种子类，较小型的取完整者，大型果实也可用分割法取所需部位。

所取样品均需有代表性，应无畸形、虫蛀、霉变或其他污染等。

(2)软化。选好样品后，新鲜或软硬适中者可直接切片，干燥材料应经软化处理后再进行切片，常用的软化方法有以下几种:

1)冷水或温水浸泡:适用于一般样品。

2)低浓度乙醇(30%～50%)浸泡:适用于含黏液质和菊糖等水溶性物质的样品。

3)水煮法:适用于木材等坚硬的样品。方法是将干燥样品投入冷水中煮沸至沉入水底，确保细胞内空气已被除尽，取出样品，放入甘油－乙醇(1∶1)的软化液中软化，至软硬适中。

4)水蒸气软化法:适用于作显微化学用的样品。方法是把样品放干燥器隔板上，再放入含5%苯酚的水适量，旋紧干燥器，一般经12～24 h，即可吸湿软化，或在干燥器中放温水不超过隔板，隔板上铺湿纱布一层，放上干燥样品，加盖密封，45℃恒温，至样品软硬适中。

(3)徒手切片。按常规法:以左手拇指和食指夹持软化好的样品材料，用中指托着，使材料略高出食指和拇指，左手肘关节靠桌沿，以免切片时晃动，右手执切片刀片，与材料的切面保持平行(刀片或材料用蒸馏水或选择的润湿剂润滑，以便于切片)，刀口向内，从左至右移动，一次切下，所得薄片厚度在10～20μm。材料和刀刃经常润湿，反复切削，将切削的薄片用毛笔沾水(或经选择的润湿剂，如稀甘油等)轻轻顺刀口方向拂下，放入盛有润湿剂的培养皿中，再选择薄而完整的切片标本，用稀甘油等封藏观察，必要时还应作水合氯醛液透化加热，稀甘油封片观察。

对较小的材料或叶片，可用小通草、胡萝卜及质厚的叶片等作夹持材料，即将小通草等夹持材料纵剖一条缝，把材料放下夹上，注意材料要放正，使切削时与刀片成一平行面。切削时连同小通草等夹持材料一起切下，放入盛有润湿剂的培养皿中，选择时除去夹持材料，按一般制片法及特殊处理制片即得。

注意:在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。切片时，两只手应该保持活动状态，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。动作要敏捷，材料要一次切下。

(4)制片。选取透明完整的切片(厚10～20μm)，根据不同鉴别目的选用适宜的试剂装片。一般植物新鲜材料，可用蒸馏水等直接装片。

下面重点介绍水合氯醛加热透化装片法:取合格切片置洁净的载玻片上，加2～3滴水合氯醛试液，解剖针混匀，于酒精灯的小火焰上微热至沸，移下，略冷，补加1滴试液，再加热至沸，如此反复至切片透明为止。一般需要2～3次(切记:加热时不要烧干)，即透化完全。加稀甘油至适量混匀，将切片摆在玻片中央略偏一方的位置，小心加上盖玻片(不要出现气泡)，用吸水纸吸去多余的试液至试液充满整个盖玻片且不游动为止，擦净玻片边缘及反面的污物，即可镜检。徒手切片经水合氯醛透化(冷浸)后，脱水染色，也能制成永久片。

2．表面制片法

本法适用于叶片、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等。另外浆果、草质茎和某些地下茎的表皮，也可制成表面装片。

(1)整体封藏法。适用于很薄的叶片、萼片和花瓣等样品，可剪取所需部位2小片，约4mm2，一反一正放载玻片上。加水合氯醛试液加热透化完全，盖上盖玻片即可。也可放试管中加水合氯醛试液加热至样品透明，再取样装片。孢子、花粉粒、雄蕊或雌蕊等，可直接装片。

(2)表面撕离法。较厚的叶片、萼片、花瓣及浆果、茎等，可用镊子将软化好材料的表皮轻轻撕下，将面朝上，放载玻片上，加水合氯醛透化至透明，加稀甘油，盖上盖玻片即可。(www.daowen.com)

3．粉末制片法

(1)粉末的制备。选取鉴定准确、具有代表性的药材，用钢锉锉下少许粉末或经粉碎过50～80目筛。量大时采用植物粉碎机，如油脂含量较高，可采用液氮研磨法。

(2)粉末制片。粉末的临时制片一般应用时做三种不同的装片，即水装片或斯氏液装片、水合氯醛透化片、染色片。

1)水装片或斯氏液装片:适用于观察淀粉粒。用解剖针挑取少许药材粉末，放置玻片中央稍偏一侧的位置，根据需要加蒸馏水或斯氏液(甘油醋酸)试液1～2滴，用解剖针轻轻搅匀，小心加盖玻片即可。不可加热，否则淀粉粒糊化。

2)水合氯醛透化片:适用于除淀粉粒、菊糖以外的大多数组织、细胞、细胞后含物的观察。取粉末少许，加水合氯醛试液1～2滴，用解剖针轻轻搅匀，置酒精灯火焰上方加热，边加热边轻搅，近干，再加水合氯醛试液1～2滴，重复上述过程2～3次，最后滴加稀甘油试液1～2滴，加盖玻片即可。

水合氯醛试液可使干燥的细胞膨胀，便于观察组织、细胞及其内含物特征。稀甘油试液能增加透明度，同时防止气泡生成，防止水合氯醛结晶析出。

3)染色片:方法同2)。水合氯醛透化2～3次后，滴加间苯三酚1滴，置片刻，再加浓盐酸1滴，静置，最后滴加稀甘油试液1～2滴，加盖玻片即可。适合于含木质素和纤维素的材料，木化程度越高，染色越深。

移取和滴加试液时，胶管滴头应保持垂直，滴嘴在粉末上方1～1．5 cm的距离。距离过大，会导致粉末飞溅;距离过小，会导致胶管滴头回吸粉末，进一步导致试液污染。粉末首次滴加液体时，避免液滴直接滴加在粉末中间，可滴加在粉末边缘。

在制片过程中，应摸索粉末和试剂的适宜用量，又快又好地做出合格的粉末临时标本片。粉末药材也可用甘油明胶做成半永久片，经脱水、染色、透明后做成永久标本片。

4．组织解离制片法

利用化学物质将植物细胞与细胞之间的中间层物质溶解，使细胞相互分离的方法，称为组织解离。解离前，将样品切成宽或厚约2 mm的小条或小块。常用的组织解离法有以下几种:

(1)氢氧化钾(钠)法:适用于薄壁组织发达，木化组织少或散在的样品。

置样品于试管或小烧杯中，加5%氢氧化钾溶液适量，加热至用玻璃棒轻压能离散为止。倾去碱液，加水洗至中性。取所需部位，置载玻片上，用解剖针撕开，稀甘油装片镜检。

(2)硝铬酸法:适用于坚硬的样品，木化组织发达或集成较大群束。

置样品于试管或小烧杯中，加硝铬酸试液适量，放置，至用玻璃棒轻压能离散为止。也可稍加热，缩短解离时间。倾去酸液，加水洗至中性，照(1)法装片。

(3)氯酸钾法:适用范围同(2)。

置样品于试管中，加硝酸溶液及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量，以维持气泡稳定产生，至用玻璃棒轻压及离散为止，倾去酸液，加水洗至中性，照(1)法装片。

用氯酸钾法解离操作时应在通风处，以免中毒。

第三节　植物组织化学鉴定

在观察植物细胞、组织结构的同时，可滴加部分特殊试剂，显示特殊颜色或者结晶等。

1．淀粉

利用碘－碘化钾溶液与淀粉的特异反应。

碘－碘化钾溶液:碘化钾3 g溶于蒸馏水100 m l，待全部溶解后再加入1 g结晶碘，溶解。使用滴加染液即可，一般呈蓝紫色。

2．脂肪和脂肪油

苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ与脂肪有显色反应。

染液:0．5 g苏丹Ⅲ溶于100 ml的70%酒精。滴染，脂肪淡黄色至红色，树脂、木栓、角质化的细胞壁樱桃色。

3．蛋白质

碘－碘化钾(I－KI)溶液:先取3 g碘化钾溶于100 ml蒸馏水中，待全部溶解后再加入1 g碘，溶解后即可使用，能将蛋白质染成黄色。

4．木质素

间苯三酚与木质素相遇呈红色，并且木化程度越高颜色越深。

间苯三酚溶液:取5 g间苯三酚的白色粉末溶解于95%酒精100 ml中(注意溶液呈黄褐色即失效)。滴染，须加30%～50%的盐酸。

5．果胶

钌红是细胞胞间层的专性染料。果胶遇钌红呈红色。

取5～10 mg钌红溶于25～50 ml蒸馏水中即可。因不易保存，应现用现配。滴染，10～30 min，蒸馏水充分洗涤，甘油封片。

6．纤维素

材料先用66．5%的硫酸溶液处理，纤维变性为胶化纤维。加碘－碘化钾(I－KI)溶液。先取1．5 g碘化钾溶于100 ml蒸馏水中，再加入0．3 g碘，溶解后即可使用。颜色反应为蓝色。

7．菊糖

材料浸于乙醇中，一星期后切片，可见细胞中的菊花状结晶。