第13章　生物材料在组织工程中的应用

13．1　组织工程概述

随着社会的发展和人民生活水平的不断提高，人们对自身健康的要求越来越高，自我保健意识日益增强，进而对医疗材料在使用上的高效、简便、舒适、无感染等方面不断提出了新要求。近年来，生物学、材料学和医学的发展十分迅速，这些学科的发展和交叉促进了一门新学科的诞生——组织工程学。组织工程学是生命科学发展史又一个新的里程碑，标志着医学将走出组织、器官移植的范畴，步入制造组织、器官的新时代。细胞生物学、生物材料学和外科学是组织工程这一系统工程的三大支撑学科。生物材料起着重要作用，有可能构成一个巨大产业，但目前存在大量的材料技术问题。

13．1．1　组织工程的意义

13．1．1．1　组织损伤修复的方法

治疗人体组织、器官的损伤和缺失是一个重大的课题。小的损伤可以自行修复，对于较大的组织损伤或缺损，必须采用手术的方法。到目前为止，已经在临床使用或正在研究的组织器官损伤和缺损的修复方法有以下6种。

(1)异体组织移植　采用他人所提供的组织或器官进行移植即为异体组织移植。这是一种相对较好的方法，但问题是排异反应和供体不足。

(2)自体组织移植　对于皮肤等组织的损伤，可以采用自身其他部位来修复更为“重要”的部位，常常与美观的要求有关。其修复效果固然很好，但这是一种以伤补伤的方法。

(3)人工合成组织代用品　该方法较为普遍，即用人工合成物或其他无生命物质临时或“永久”地代替所损伤的组织器官。但是毕竟所谓的“组织”并无生物活性，除了排异反应以外，还明显存在性能不全面的问题。

(4)克隆技术　用人的单细胞克隆出人体或人体的一部分。该技术本身目前并不成熟。此外，即使将来技术上成熟了，也会遇到社会伦理问题。

(5)组织工程技术　用一部分非生殖性的无序的细胞再造有序的细胞聚集体——组织或器官。本节将详细论述。

(6)原位诱导再生技术　植入可降解的生物材料，最终却得到由自体细胞构成的组织器官。这是组织工程技术的姊妹方法。

13．1．1．2　组织工程的含义及其意义

以往的异体移植和人工替代物分别有供体不足以及长期植入后的免疫排斥等问题。组织工程技术则提供了一种崭新的修复和制造器官的手段。第一届中国组织工程会议指出:“组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与方法，研究、开发用于修复、增进或改善人体各种组织或器官损伤后功能和形态的一门新兴学科，是生命科学发展史上又一个新的里程碑，标志着医学将走出组织、器官移植的范畴，步入制造组织、器官的新时代。同时组织工程是一门多学科交叉的边缘学科，将是21世纪具有巨大潜力的高技术产业，必将产生巨大的社会效益和经济效益。”

简单地说，组织工程技术拟通过将体外扩增的人体细胞植入三维生物材料多孔支架，复合体植入人体后或在模拟体液的环境中，伴随着材料的逐步降解，细胞分泌细胞外基质而粘连形成所需的组织(器官)。这是一种用活细胞再造或修复组织的新方法，将是21世纪外科学的一次革命。细胞生物学、生物材料学和外科学是组织工程这一系统工程的三大支撑学科。

“组织工程(tissue engineering)”一词来源于1987年美国国家科学基金会的报道。1993年，美国哈佛医学院研究型的外科医生Vacanti教授和麻省理工学院的高分子材料化学家Langer教授联合在杂志《Scierice》上撰文介绍组织工程，带动了组织工程的交叉学科研究在美国的兴起。由于其巨大的经济价值和对于学科发展的意义，全世界的组织工程热在世纪之交迅速升温。目前，组织工程产品尚未大规模普及，组织工程研究开发处于最后攻坚阶段。在生物医用材料中，治疗器官的衰竭和组织的缺损所涉及的医用材料所需费用十分惊人。以美国为例，每年有数以百万计的人患有各种组织、器官的丧失或功能障碍，需进行800万次手术进行修复，年耗资超过400亿美元，器官衰竭和组织缺损所需治疗费占整个医疗费用的一半，而其中生物材料的费用几乎占“半壁江山”。

中国是一个人口大国，病人的数量一定十分庞大。随着人民生活水平的提高和对生命质量的追求，我国在此方面的医疗费用也会不断增加。可见，生物材料是一个巨大的产业。生物材料的不可缺少性，尤其是进口材料动辄上万元的价格，决定了我国必须加强具有自主知识产权的生物材料的研究和开发。此外，随着我国医疗制度的改革，必须自费的医疗费用中的一大块是生物材料，尤其是进口材料，这给工薪阶层带来了沉重负担。因此，必须加强生物材料的研发。中国在组织工程研究方面虽然离美国尚有差距，但从世界范围看，并不落后，在不少方面甚至处于较为领先的水平。目前，国内外的组织工程研究从生物材料、组织构建以及细胞分化和扩增各个方面全方位展开。相比而言，我国在组织构建方面较为领先，切合实际地计划以皮肤、软骨、骨、肌腱、角膜等相对“容易”的组织的构建方面作为突破口，并已经取得了重大进展。有些不仅通过了大量的动物实验，并且已在初步的人体临床中取得成功。但到目前为止，临床实验以及大部分动物实验中所需的生物材料仍然主要采用了国外的产品，价格昂贵。具有自主知识产权的生物材料对于中国未来的组织工程产业至关重要。

13．1．2　组织工程的三要素

组织工程是一个典型的交叉学科。它涉及多个方面，其中至少包含3个方面的内容，即种子细胞的获得、支架材料的制备和组织的构建。

13．1．2．1　种子细胞

组织工程技术可以理解为将大量细胞三维有序化构成组织。没有种子细胞将成为无米之炊。

组织工程需要广泛的细胞来源，其途径包括下列几种。

(1)自体细胞　取少量自体细胞进行扩增，用较小的“不重要”的部位修补大块的或重要部位，这样免疫排斥问题最少。这种以伤养伤的方法显然不是组织工程的初衷。但是需要指出，即使采用自体细胞作为种子细胞，组织工程比起自体组织移植还是进了一大步。组织工程所需要的初始种子细胞的量还是要比自体组织移植要动用的细胞少得多，并且对于种子细胞而言，无组织器官水平上形态和功能的要求。

(2)同种异体细胞　采用他人的细胞。这是一个重要的方法，手术成功率可能较高。但是，同样存在供体来源问题。

(3)异种细胞　如果能够以猪等大型哺乳动物的细胞来代替人体细胞并植入体内，则细胞来源问题可以得到解决，但是免疫排斥问题将十分显著。

(4)干细胞　鉴于免疫排斥问题和细胞数量问题(与供体问题相关)，组织工程种子来源的根本出路在于干细胞技术。当然，干细胞本身的来源也可以为自体干细胞、同种异体干细胞和异种干细胞3种情况。原则上讲，很少量的干细胞可以增殖分化得到大量所需要的组织细胞，因此，干细胞技术如果成熟，容易采用自体干细胞，至少是同种异体干细胞，这就为组织工程的理想种子细胞来源提供了广阔的前景。

组织工程所期望的干细胞主要分为胚胎干细胞和骨髓基质干细胞两大类，前者具有全能的分化性，但是在技术上很不成熟;后者的分离和随后的增殖分化相对容易，是目前组织工程研究中的热点之一。但是，骨髓基质干细胞定向分化为骨细胞相对容易，而分化为其他多种组织细胞的能力尚待提高。

种子细胞面临的另一问题是细胞老化问题。正常细胞的传代数目是有限的，到老化之后就会自行启动程序式细胞凋亡;而如果通过端粒酶等手段抑制了细胞凋亡，则细胞的无休止增殖本身也是有害的，甚至会导致癌变。

此外，由于组织工程技术所需要的种子细胞数目很大(一般在50×106/mL)，即使种子细胞原则上可以拿到，要大规模应用仍然需要细胞的工程化培养技术;种子细胞的冷冻保存和复苏技术也很重要。总之，种子细胞极为重要，目前仍为组织工程发展的瓶颈之一。

13．1．2．2　可降解材料支架

大量细胞的简单堆积难以形成三维组织，因此，需要将细胞种植在多孔的三维支架之中，而支架本身又具有所构建组织器官的外形;随着支架的降解，细胞逐步粘连形成所需要的组织器官。这就是组织工程技术的原始思想，并且其可行性已经得到证明。可以将用于组织工程的可降解生物材料支架比喻为一个细胞过了河就要拆掉的“桥”。生物材料是组织工程中必不可少的重要组成部分。其中，大量的技术问题需要解决。后面将详细论述。

13．1．2．3　组织构建技术

组织构建是组织工程的总装配阶段:将种子细胞种植在三维多孔支架的表面，得到细胞与支架的复合物，并最终得到所需要的组织器官。组织构建包括两大类方法。

(1)完全体外构建组织　所谓完全体外构建，就是将上述细胞与支架的复合物在模拟体液的体外环境中构建得到具有外形和功能的人体组织器官。目前，完全的体外构建还很困难。

(2)最终体内构建组织　完全体外构建组织之所以困难，关键在于目前人类尚不能真正在体外模拟得到与体内一模一样的环境，例如，体外构建的角膜的光学透明性往往较差，甚至有颜色，而在动物眼部所得到的组织工程角膜则光学透明性大大提高。考虑到体内的细胞因子、力学环境、免疫环境等的复杂性，目前组织工程的大量实验仍然在动物体内进行。但一般体内构建之前，会先在体外培养2～3天，以让细胞黏附在支架内表面;只是最终的组织构建在体内进行。

组织构建过程中一般要添加一些细胞因子。细胞因子一般为体液中的一些活性蛋白质，种类繁多。如何添加各类细胞因子对于从事干细胞分化研究和组织构建研究的工作者来说是一门很高的艺术。

组织工程研究中，组织构建的动物实验是有层次的，一般要经过4个阶段。

(1)通过无免疫力的裸鼠实验证明组织形成能力。曹谊林教授在美国时于老鼠背上长耳朵的著名实验就是利用软骨细胞和合成高分子材料在裸鼠体内进行组织构建的范例。

(2)鼠、兔等小型哺乳动物体内的组织构建以考察免疫反应(有时也采用鸡等小型动物)。

(3)羊、狗、猪等大型哺乳动物体内进行考察。

(4)成熟并经批准以后才能进入人体临床实验。

体内实验仍然是重点。即使将来采用完全体外构建，最终也要把所构建的组织器官植入体内，以考察免疫反应及长期效应。有时组织形成之后还会发生其性能有所下降的现象。此外，组织工程有时是先得到一个器官，解决原有同种异体器官移植的供体来源问题，然后采用外科手术对于缺损器官进行替代;有时则对于损伤组织器官进行原位修复，此时，不可能采用体外构建的方法。

细胞生长和组织形成与其力学环境有很大关系。成纤维细胞和肌腱细胞在张应力环境下会各向异性生长，所形成的组织方能抵抗张力。组织构建要在模拟体外力学环境中进行，这点十分重要。

未来的组织工程构建技术不仅要解决大规模工程化的问题，还需要解决个性化问题。将来给一个人换一个鼻子可以采用各式各样的组织工程化的活性鼻子以供人选择;但是，一只耳郭的缺损则必须根据另一只耳郭的外形加以个性化的耳郭构建;颅骨缺损也希望所填补的部分与其他部分完全吻合，这样的组织不可能采用预先批量生产。个性化组织构建给组织工程材料支架的制备带来了挑战，也要求迅速得到大量的种子细胞。总之，组织构建技术综合了种子细胞与生物材料。组织工程学的学科交叉性极强。

原位组织诱导再生技术与组织工程技术有一定的相似之处。组织工程技术一般采“细胞+支架→组织器官”的方法，即将体外大量扩增得到的细胞种植在生物材料多孔支架上，在体外和体内的培养过程中，随着生物材料降解细胞分泌大量的细胞外基质，最终形成了由活细胞构成的组织器官。随着组织工程技术的发展，原有的组织诱导再生技术也得到了长足的进步。组织诱导再生不同于组织工程之处在于，它不需要添加外源的细胞，只在体内植入多孔材料，期待体内的细胞自行长入支架并最终代替可降解的支架。可见原位组织诱导再生也隐含种子细胞、材料支架和原位组织构建三要素，只是对于种子细胞的要求相对容易满足。

一般来讲，原位组织诱导再生技术相对容易在临床应用，但局限于较小尺寸的组织和器官的修复。而组织工程技术原则上适用于各种尺寸和形状的组织及器官的修复与再造，且由于外源细胞的参与，使其对于某些难愈合损伤更具疗效，但是实施的难度更大。当然，国内外对于组织工程和组织诱导再生的名词本身还有一些不同的理解，如有人把组织诱导再生称为“原位组织工程”。不论怎样，组织工程和组织诱导再生都是有效的再生医学手段，都需要可降解材料支架，并且对于材料支架有相似的要求。以下所论述的组织工程材料一般也适用于原位诱导再生材料。

13．1．3　组织工程材料的要求

相比于组织构建而言，中国的生物材料研究更需加强。组织工程材料是对于细胞外质的仿生。一般说来，用于组织工程细胞支架的生物材料至少应满足以下几个要求。

13．1．3．1　生物降解性

如前所述，组织工程材料支架是一个最终要被拆掉的“桥”，要求材料本身在体液环境可以降解，且降解产物具有生物可吸收性。降解速率与细胞生长和组织器官的形成速率要相匹配。

理想的匹配情况为组织尚未形成时，整个细胞与支架的复合物的力学强度由多孔支架来支撑;而一旦组织已经基本形成，则希望支架迅速解体。如果支架降解过快，在组织尚未形成或尚不足以承担力学负荷时支架已经不起主要支撑作用，则组织最终将不能形成;反之，若支架降解太慢，则会妨碍细胞扩增等，组织形成的时机被错过，即使支架完全降解之后组织也最终不能较好地形成。

理想的组织工程材料应具有可以调节的生物降解性质;对于不同的器官和动物，甚至不同个体，有不同的降解速率的要求，即需要不同的材料或具有不同参量的同类材料，并选择合适的凝聚态结构和加工方法。组织工程材料的降解周期一般要求在2周到1年，以2～3个月居多。

13．1．3．2　生物相容性

这是所有医用材料的共同要求，但是组织工程材料由于要求可控降解且用量较大，生物相容性的问题较为严格，不容易满足。不仅要无毒，而且要具有良好的细胞黏附性和组织相容性，没有炎症反应。

要特别注意由于降解产物所导致的生物相容性问题。这里的炎症反应有时属于无菌性炎症，主要由酸性降解产物和降解后期产生的颗粒所导致的巨噬细胞等免疫细胞的聚集所致。降解产物的影响在体内组织构建时尤为突出。

13．1．3．3　可制备加工性

组织工程支架的可制备加工性主要表现在以下几个方面。

(1)三维孔结构支架　要具有三维多孔结构，有很高的孔隙率(一般大于90%)，以满足物质交换、细胞再生的足够空间以及血管和神经的内生长。一般认为孔径应为50～500 μm，依不同的组织细胞而变化，多数为200～300 μm;孔型应为开孔，既可容纳大量细胞，又可为这些细胞提供营养物质以及代谢产物和气体的交换通道。

(2)复杂外形　除皮肤以外，人体组织器官都具有较为复杂甚至十分复杂的外形，要能做到内部多孔而外形复杂。

(3)表面的细胞亲和性　多孔材料的内表面能与细胞亲和，使细胞黏附并生长，这是细胞生长的前提，十分重要。

(4)适宜的力学性能　力学性能除了模量以外，还包括拉伸强度、压缩强度、冲击强度等，即材料支架除了要有一定的硬度以外，其强度要高，韧性要好。原则上，材料的力学性能应该与所修复的组织器官的环境相匹配，使其在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提供合适的微应力环境。过高和过低的力学参量都不好。但对于组织工程材料，普遍的问题是:力学强度在高孔隙率时显得不足。支架在组织形成的早期必须能提供力学支撑。但是，对于如此高孔隙率的材料，又有降解性和生物相容性的要求，支架力学性能的要求往往不易满足。这里所要求的力学强度应该是在体液环境中的强度而不限于在干燥状态下的测量结果。

(5)可消毒性　材料要易于消毒、保存。在满足上述4点的前提下，易于消毒未必容易做到。例如，高温消毒尤其是湿热灭菌就很容易导致可降解高分子材料的降解。

13．2　组织工程支架材料

迄今为止，人们已经成功地复制出人工耳、人工血管、人工肌腱以及塑形精确的人工软骨(包括关节的指骨)等组织，肝、肾等实质性器官的功能性细胞培养与植入呼吸道及消化道等管状器官的上皮组织培养和植入人工器官的培养等方面都取得了令人振奋的研究成果。目前支架在组织工程方面的应用主要有软骨组织工程、骨组织工程、皮肤组织工程、神经组织工程等。

13．2．1　软骨组织工程

与硬组织可以自然痊愈的特点不同的是，软骨组织一旦损伤很难治愈，因此，在体外培养再生移植用软骨即组织工程化人工软骨有很大意义。在软骨组织工程中，三维支架已起到临时细胞外基质作用，为软骨细胞提供附着、增殖、分化和代谢的场所。软骨细胞以其附着的三维支架为模板形成新的软骨组织。因此，支架材料在组织工程化软骨的形成过程中起着十分重要的作用。生物相容性和生物可降解性是软骨组织工程支架材料的基本要求。组织工程支架材料及其来源分为天然生物材料和合成生物材料。

13．2．1．1　天然生物材料

天然生物材料是软骨组织工程中应用较早的支架材料，如纤维蛋白、胶原蛋白、甲壳素和壳聚糖、透明质酸、海藻酸及其复合材料等。在其加工制成的凝胶或海绵的三维支架上，软骨细胞生长、代谢良好，能产生足够量的基质，形成软骨组织。

(1)壳聚糖　壳聚糖是一种天然的生物多聚糖，对软骨细胞有较好的吸附作用，可促进细胞在材料上增殖和分化，是组织工程化软骨构建中的较适宜的一种生物材料。有人以壳聚糖无纺网作为细胞培养支架，将其与兔关节软骨细胞一起进行体外培养，最后将壳聚糖与软骨细胞复合物移植到同种异体兔膝关节软骨缺损处，以对侧膝关节为对照，在术后16周对关节软骨缺损的修复过程观察。结果显示术后16周可见实验侧关节软骨缺损处有新生的软骨组织，与周围正常的软骨组织紧密相连，关节面光滑。电镜下可见成熟的软骨组织，而对照侧关节面粗糙，表现为纤维组织愈合，且实验侧的修复组织厚度与对照侧比较有显著性差异。实验证明了壳聚糖作为软骨细胞移植的载体，可为软骨细胞的生长繁殖提供合适的微环境，软骨细胞移植术后16周关节软骨缺损得到较好的修复，为临床上关节软骨缺损的修复提供了有效途径。有人用壳聚糖和硫酸软骨素A共混制得膜，并将牛的关节软骨细胞置于膜上培养，结果发现牛的关节软骨细胞可以很好地贴附于材料上，生长良好且保持了软骨细胞的表型特征。证明了壳聚糖有可能作为自体软骨移植载体材料或者用作组织培养骨架。

(2)胶原蛋白　胶原材料是一类优良的组织工程用可降解生物材料。有人曾用胶原凝胶进行软骨细胞的三维培养，获得了稳定的软骨细胞表型。在胶原凝胶内的软骨细胞可产生大量的蛋白多糖(PGs)和Ⅱ型胶原蛋白基质。近年来，国内也有用天然胶原材料作为组织工程软骨支架的研究。朱如里等用人胎盘I型胶原海绵作为兔软骨细胞的三维培养支架，证明了人胎盘工型胶原海绵是软骨细胞三维培养的较好支架。杨志明等将人胚胎关节软骨与胶原蛋白海绵复合后植入裸鼠皮下，构建出的软骨组织外观和组织形态与天然软骨极为相似，生物力学测试其压缩模量与天然软骨达到同一数量级。蔡哲等在完成体内培育牛透明软骨和人肋软骨的研究基础上，选择可以为软骨细胞的增殖和功能发挥提供天然微环境的天然胶原为主的材料，作为软骨细胞培养支架，实现了体外培育软骨的愿望。

(3)透明质酸(HA)HA是天然软骨细胞的一种重要的细胞基质成分，对调控软骨机械性能起重要作用，同时，由于HA可维持糖胺聚糖聚集体的结构，给软骨基质带来了弹性强度。因此，将HA用于软骨组织工程是很合理的。无纺布的HA苄基酯以其优异的细胞相容性而作为软骨组织工程支架。Grigolo等从人软骨活检组织中提取的软骨细胞植入三维无纺布HA苄基酯中进行体外培养，从细胞黏附性、细胞相容性、增殖、活性、细胞接种的均一性等方面证明无纺布的HA苄基酯具有良好的性能，在培养4周后能检测到Ⅱ型胶原的存在，证明了软骨细胞再分化的潜力。同时还研究了在HA苄基酯上培养的软骨细胞对兔软骨愈合的作用。在新西兰兔股骨内侧股骨骨节的承载面上创造全层缺损，用在生物材料上接种的软骨细胞以及单独的生物材料进行修复，研究证明HA苄基酯作为软骨细胞移植的支架，与没有移植软骨细胞的支架相比，能明显提高软骨缺损的愈合;组织学和组织形态学显示用HA苄基酯自体软骨移植能有效提高关节软骨修复的能力和组织修复的质量。因此，HA苄基酯有希望作为自体软骨移植的支架，应用于人体治疗早期的骨关节炎、分离性骨软骨炎、骨软骨骨折和髌骨软骨软化。

(4)海藻酸　有学者用海藻酸凝胶作为软骨ECM材料，研制出可注射的软骨细胞海藻酸盐凝胶悬液。注入体内培养一段时间后，通过组织学证明形成了软骨组织。Paige等将牛软骨细胞与海藻酸凝胶制成的支架移植入裸鼠皮下，形成的软骨组织与原软骨极为相似。

(5)复合材料胶原　凝胶是较好的培养软骨细胞的基质，但缺乏强度和刚性，不易和缺损部位缝合，故希望开发复合软骨组织工程支架材料。池光范等用工型胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维培养，构建人工软骨组织，3周后，I型胶原降解逐步形成了有一定机械强度和弹性的组织工程人工软骨，而且活跃地合成、分泌Ⅱ型胶原。结果证明胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶构成类似体内关节软骨组织的三维细胞外生存环境，促进幼稚关节软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原合成分泌向软骨方向发展，是一种在体外构建较大体积同种异体化组织工程软骨用于关节软骨损伤修复的一种方法。胶原一糖胺聚糖基质是适于关节软骨再生的基质。Alleman等研究了HA对在三维胶原骨架中工程化关节软骨细胞外基质基因表型的影响，结果发现三维胶原骨架中少量的HA能促进软骨形成，显示改性的胶原一HA骨架有提高组织化工程产品在体内应用的潜能。Angele等将酯化的透明质酸和明胶复合，研究这种新型的复合材料基质促进培养扩增的骨髓间叶细胞起源细胞的分化以作为工程化软骨和骨的潜能。三维骨架中的HA和明胶两种基质成分能为体外细胞黏附、细胞分化、细胞外基质的产生，以及软骨组织的形成提供极好的环境。Milales等研究HA对海藻酸钠海绵在体外软骨工程中的作用。在海藻酸中加入HA，可为软骨细胞合成蛋白多糖和胶原提供合适的环境，对细胞增殖和蛋白多糖的合成起促进作用，而软骨细胞的表型和蛋白多糖合成的增加是体外新软骨形成的有利因素，因此，在海藻酸海绵中加入HA能得到类似天然软骨的细胞外基质。

13．2．1．2　合成生物材料

人工合成的聚合物材料因其可以精确地控制其相对分子质量、降解时间、疏水性和其他属性，而成为软骨组织工程重要的支架材料。目前，用于软骨组织工程的合成材料主要是聚酯类的聚乳酸、聚羟基乙酸以及它们的共聚物。

聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)均属于聚α－羟基酯类，具有良好的生物相容性，是美国食品药品管理局认可的体内植入材料，是目前组织工程中广泛使用的支架材料。Freed等用聚乳酸(PLLA)作为三维支架材料，通过改善实验条件，在体外培养出软骨组织。PLLA的降解产物为乳酸，软骨细胞对其耐受性好，但其相对分子质量大，结晶度高，降解速度慢，在体内可长期存留，与新生软骨再生速度不匹配，而且其疏水性亦不利于种子细胞黏附。PGA的优点在于它具有良好的生物相容性，用于软骨组织支架工程材料可以很好地引导、促进软骨细胞的黏附、增殖和分化，形成软骨组织。软骨细胞接种在无纺网后构建组织工程化软骨，已被一系列的研究证明是一种有效的方法。Freed等P将牛软骨细胞接种在PGA三维支架上培养，发现软骨细胞数量持续性增长，培养到6周时软骨细胞数已达到接种时的8．3倍。有人用PGA纤维制成片状三维支架，将软骨细胞接种在其上，然后将该片环包于硅胶圆柱管上，植入裸鼠体内，经过4周体内培养，形成了圆柱状组织工程化软骨。但PGA降解速度快，已出现崩解，单纯PGA支架只能维持其结构完整性3周左右，而且其降解产物羟乙酸酸性大，pH值下降明显，软骨细胞对其耐受性差。因此，把两者的优点结合，在PGA纤维表面涂覆一层PLLA，以减慢其降解速度。更多的是将PLA和PGA按一定比例混合(PGA/PLA)或将其单体共聚(PLGA)。大量实验证实，PLGA是理想的软骨组织工程支架材料，通过调整两种单体的比例，可根据需要制备成任意所需降解速度的基材。Cao等用涂层PLLA的PGA无纺网塑形成人耳状的支架。接种软骨细胞后移植到裸鼠皮下。经一段时间后培养出耳形状的软骨。这一实验表明了组织工程化软骨在全耳重建中临床应用的可能性。

13．2．2　骨组织工程

一个世纪以来骨缺损的修复一直是不断深入研究的重要课题和热门话题之一，然而迄今为止临床上对创伤、感染和肿瘤切除后所造成的大范围骨缺损的修复仍没得到有效的解决，骨组织工程研究重点是寻求能够作为细胞移植与引导新骨生长的细胞支架，作为细胞外基质的替代物。骨与其他结缔组织一样，也是由细胞、纤维和基质3种成分组成。骨基质主要是由胶原、非胶原蛋白、蛋白多糖类、脂质和磷酸钙(主要是羟基磷灰石)等组成。目前，在骨组织工程研究中应用的基体材料主要包括陶瓷材料、天然和人工合成高分子材料以及复合材料。

13．2．2．1　陶瓷材料

生物活性陶瓷不仅具有优良的组织相容性，而且还能与机体组织有选择性地发生化学反应，形成有机的界面结合。生物活性陶瓷的骨引导再生作用已被大量的研究结果所证实。生物活性陶瓷的主要作用是三维结构的支架作用，以利于宿主骨床的血管和成骨性细胞的长入。目前，用于骨组织工程的生物活性陶瓷材料包括生物活性玻璃、羟基磷灰石(HAP)、磷酸三钙、磷酸钾钠钙、钙磷陶瓷即羟基磷灰石和磷酸三钙(HA/TCP)及珊瑚转化的羟基磷灰石(CHA)等。

(1)生物活性玻璃　1970年美国Hench开发了活性玻璃Bioglass。生物玻璃是基于人骨成分设计的，已成功用于人体硬组织的修复，它不诱导异物反应，能与生物体内的骨组织发生化学结合。生物玻璃分为非生物活性玻璃和生物活性玻璃。非生物活性玻璃可用于股骨头、齿冠、体内治疗癌症;生物活性玻璃可制作听小骨、人工齿骨、脊椎骨、长骨、齿根、齿冠、骨填充材料等。

(2)β－磷酸三钙　生物降解类陶瓷主要为磷酸三钙(TCP)，在骨组织修复中起暂时的骨性支架作用，能促进骨组织生长。由于其良好的骨传导性能和生物活性，已广泛用于矫形外科领域。β－TCP具有良好的生物相容性和生物可降解性，使其成为理想的骨移植材料，用于修复因创伤、肿瘤或骨病等原因所致的人体骨组织缺损，替代自体骨或同种异体骨、异种骨移植。

(3)羟基磷灰石(HAP)HAP广泛存在于人体和动物的骨骼和牙齿中，是其主要的无机成分。由于HAP具有良好的化学稳定性和生物相容性，能与骨形成紧密的结合，是一种很有应用前景的人工骨和人工口腔材料。HAP的化学组成和结晶结构类似于骨骼系统中的磷灰石，因此适宜作为骨替代物。杨志明等将兔骨膜成骨细胞分别与HAP、HAP/TCP体外联合培养，发现在HAP上培养的成骨细胞形态单一，体积较小，排列疏松，植入体内后未见成骨现象; HAP/TCP上成骨细胞排列紧密，形态多样化，并有丝状伪足，植入体内后可见材料上有团块及板层骨形成。因此，为了更好地将HAP用于骨组织工程，应研究将其与各种材料如胶原、HA、BMP等复合。

(4)珊瑚转化的羟基磷灰石　珊瑚是一种海生无脊椎动物的骨骼，其化学成分99%为碳酸钙，以及少量其他元素和有机成分，类似无机骨。具有多孔性和高孔隙率，有利于缺损骨组织的替代，在骨缺损修复中起到传导作用。在新骨形成过程中，其降解产物及残留的碳酸钙成分可以为新骨组织提供原料而被利用，因此，特别适合于骨组织工程的构建。它是将珊瑚经水热交换反应，钙转变为羟基磷灰石。其机械强度增加，但不可降解，对于骨组织工程仍有一定的临床实用价值。(www.daowen.com)

13．2．2．2　高分子材料

天然及合成的可降解高分子材料是另一类用途广泛的骨替代材料。目前研究最多的合成材料是PLA和PGA以及它们的共聚物，天然材料有甲壳质和壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白等。

(1)合成高分子材料　聚α羟基酯类。采用物理或化学手段修饰PLA，使其具有更好的生物性能，成为更好的细胞外基质材料培养细胞。PLA作为骨细胞培养支架，研究表明该材料对成骨细胞的生长具有良好的诱导增殖效果。PLA与重组人骨形成蛋白复合作为下颌骨修复材料取得了较好的效果。有学者用成年白兔桡骨缺损以引导骨再生，手术后18～24个月组织学评价结果显示，该密质骨缺损基本愈合。PGA无纺布网是另一类应用较广的组织工程支架材料。Breitbant等将PGA无纺纤维支架体外培养的兔骨膜成骨细胞，植入修复颅骨缺损，12周后缺损区大量骨生成，完全修复骨缺损。PGA吸收速度很快，力学强度较差，不能满足骨组织的要求，一般可用PLLA溶液黏合PGA无纺布网的方法使其增强。PLGA是目前研究较为深入的骨组织工程支架材料，但其强度不足以作为骨组织工程支架材料使用，可将其与HAP晶须复合增加其强度。

聚酸酐。聚酸酐也可作为骨缺损修复材料，Attawia将酸酐和亚胺聚合共聚物做成骨细胞培养载体，结果表明细胞黏附良好，形态正常，共聚物对成骨细胞有良好的相容性，不影响细胞表型表达。

(2)甲壳质和壳聚糖　甲壳质和壳聚糖可制成骨缺损修复材料，倪斌等将甲壳质膜包绕覆盖于兔桡骨缺损处，对断端间骨组织再生起架桥连接作用，并通过对骨膜下骨痂的导向性生长作用，达到骨组织愈合。壳聚糖植入家兔前肢骨缺损实验证明:骨细胞可在其支架上爬行替代、生长良好。目前，单一的甲壳质、壳聚糖及其衍生物作为骨科材料用于临床的研究不多见，通常将其与其他材料复合作为骨科材料。

(3)透明质酸及其衍生物　透明质酸苄基酯是由天然的透明质酸通过酯化衍生而来的，它是不同细胞类型的优良载体(角化细胞、软骨细胞、基质细胞)，当引入骨缺损中，则可提供合适的支架和有利的微环境以促进骨修复过程。Lisignoli等将无纺布的透明质酸苄基酯与骨髓基质细胞(BMSCs)结合研究鼠模型中大面积骨缺损中的骨生成。分别在40天、60天、80天、200天后进行缺损愈合评价，体内研究证明透明质酸苄基酯是骨缺损修复的合适载体，并且当和BMSCs以及碱性成纤维细胞生长因子结合时能大大加速骨的矿化。

(4)胶原蛋白　胶原蛋白是应用较多的骨组织工程支架材料，但由于强度较弱，赋形能力差，用于骨组织工程时有必要进行增强处理，以提高支架的压缩强度，利于骨重建中的应力传递。Ueda等用交联的胶原蛋白海绵结合转移生长因子(TGF)－β1来促进骨的修复。通过改变热交联的时间可以调节胶原海绵的体内降解速度，从而控制TGF－β1的释放速度。实验证明TGF－β1与胶原海绵结合，能促进小鼠头盖骨缺损的没有承载压力部位的骨再生，胶原海绵是释放TGF－β1的载体基质，有助于维持成骨活性。目前，应用较多的是将BMP－2脚生物材料复合植入体内，BMP－2可刺激体内的骨前体细胞来诱导成骨，而生物材料可促进骨组织和血管的长入。李广恒等将rhBMP－4和工型胶原构建一种细胞载体，将一定量的精髓基质干细胞吸附在载体上，植入兔脊柱的关节突之间来诱导脊柱融合，实验结果证实新髓形成良好，获得了良好的脊柱融合效果，证明应用含有骨生长因子、骨前体细胞和胶原载体的复合物是一种较为理想的自体骨组织替代物。

13．2．2．3　复合材料

用于骨组织工程的复合材料有羟基磷灰石与壳聚糖复合、β－磷酸三钙与壳聚糖复合、羟基磷灰石与胶原蛋白复合、羟基磷灰石与PLA、PLGA等复合。

(1)陶瓷材料－壳聚糖复合材料　陶瓷材料与壳聚糖的复合物。具有良好的生物相容性。国内外研究者对HAP壳聚糖复合材料进行了大量的研究，认为壳聚糖与HAP有很强的交互作用，并且对磷酸八钙(骨质生长的初始阶段无磷酸八钙)的结晶增长有显著的影响。Pa等以HAP和壳聚糖材料作为骨移植的生物材料来修复兔胫骨缺损，复合材料具有良好的生物相容性和生物机械性能，而且发现在HAP中加入适量的壳聚糖可以增加HAP颗粒的赋形性和降低复合材料的刚性。研究人员用溶胶－凝胶法制备了HAP/壳聚糖－明胶网络复合材料，结果表明复合材料的弯曲强度达到了密质骨弯曲强度的下限，断裂强度接近人体密质骨。因此，证明此复合材料是较为理想的骨缺损修复材料，其成骨方式为软骨化骨。壳聚糖与TCP复合作为骨缺损修复材料，具有良好的可塑性和操作性能。Lee等采用壳聚糖/TCP作为三维支架体外培养成骨细胞，扫描电镜检查显示细胞与材料吸附较好，细胞生长良好，显示了壳聚糖作为体外培养成骨细胞的三维支架的潜力。Yao等以水为致孔剂采用冷冻干燥法制备了TCP/壳聚糖－明胶网络复合多孔支架。兔皮下植入实验证实此复合材料在植入初期引起轻微炎性反应，随着植入时间增加，支架材料降解，炎性反应也相应减轻，至12周基本消失。表明此复合材料可作为骨组织工程支架材料。

(2)羟基磷灰石－胶原复合材料　骨是具有复杂分级结构的天然复合材料，其组分经过精巧的组装而获得优异的性能。模拟天然骨的成分及结构特征制造的骨替代材料，可为细胞提供与天然骨相类似的微环境，因而有望成为优异的骨组织工程材料。胶原基质是目前研究的热点，因为胶原分子的模板功能对天然生物矿化有重要作用。研究人员采用材料学自组装的原理，以工型胶原为分子模板，引导钙磷盐在液相中矿化，制备具有天然骨基质层状结构的HAP/胶原复合材料，并以热致相分离法制备HAP/胶原－聚乳酸复合三维多孔框架，与rhBMP－2处理后的骨膜细胞组合成细胞－材料复合体，植入裸鼠皮下，在8周观察到框架孔隙内形成大量骨基质，并伴有毛细血管长入。骨主要是由羟磷灰石纳米晶体(c轴大小为20～40 nm)和胶原纤维(分子长300 nm)组成的。纳米相HAP和胶原的复合材料正是基于仿生的观念制成的骨替代材料。kazaki等制成成分与结晶度同骨矿相似的碳酸磷灰石，与胶原溶液混合后用紫外线照射交联胶原制成复合材料，在大鼠皮下植入实验中显示了良好的生物相容性。崔福斋等以提纯并去抗原的Ⅰ型胶原为模板，在钙－磷盐溶液中调制矿化而获得复合材料，体外实验证明材料具有生物降解性。将材料植入兔股骨骨髓腔中，材料表面有新骨形成，同时材料逐渐被降解吸收。这种复合材料应用于骨组织工程的初步研究结果令人满意。Itoh等用羟磷灰石/胶原蛋白复合材料制成了人工椎骨体。复合材料的机械强度为(39．5±0．882) MPa，杨氏模量(2．54 ±0．382) GPa，满足骨移植材料的要求，并且与自体松质骨相同。体内实验证明复合材料可以被破骨细胞类细胞的吞噬作用所吸收，引导破骨细胞在周围区域形成新骨。复合材料高度的生物活性使它与骨有相同的成分和纳米结构。

将生物活性的HAP－胶原蛋白复合材料进一步与HA复合可增加湿态下复合材料的黏结性。同时，生物高分子的胶原蛋白和HA结合为骨在HAP相邻粒子间空隙内的向内生长提供了相对低密度的可吸收介质，而且HA能帮助形成更具有生物活性的骨架，以支持骨向内生长。借助于与胶原蛋白的结合，HA可极大地影响骨在体内的重建。Bakoes制备了HAP－胶原蛋白－HA复合材料。实验证明HAP－胶原蛋白－HA复合材料的机械性能比HAP－胶原蛋白复合材料的机械性能更好，没有细胞毒性，是一种极好生物相容性的生物材料，它的高黏合性为骨植入材料提供了一种新的生物材料。

(3)陶瓷材料与PLA、PGA及PLGA复合　陶瓷材料与可降解的合成聚合物如PLA、PGA及PLGA复合后植入体内不引起宿主组织的任何不良反应，并能加速骨组织再生。Yasunaga等研究超高强度的烧结HAP颗粒/PLLA复合材料与兔胫骨皮质结合行为表明，植入物和骨的结合强度比PLLA大很多，其界面可观察到纤维组织。Laurencin等研究设计了三维HAP/PLGA(50/50)多孔支架，用于骨组织的再生和修复。此外，还将PLGAHAP支架种植可合成骨形态发生蛋白的细胞，再将细胞/支架结构植入到严重免疫缺损鼠的四头肌肉，结果表明，此复合材料持续释放BMF－2，诱导新骨的形成。Laurencin通过HAP－PLGA多孔支架的鼠颅骨成骨细胞培养实验表明，种植细胞24 h后可观察到细胞黏附在支架孔壁上，并迁移到支架内部;支架内的细胞保持成骨细胞的形态，成骨细胞黏附且迅速增殖直到两周、三周达到稳定值;同时可观察到矿化基质，培养期内细胞表达骨钙蛋白和碱性磷酸酶，说明HAP/PLGA复合材料可支持成骨细胞的生长，可望将其用作骨组织工程支架。田中顺三等综合聚乳酸的生物降解性和pTCP的骨传导性制成了TCP/PLA复合膜材，用于颚骨重建。将病人骨缺损部位用复合膜材缝合，术后4周骨缺损部位长满软组织，12周后骨缺损重建，在骨组织中形成骨小梁。因此，该材料可望用于口腔外科和整形外科领域。

13．2．3　皮肤组织工程

皮肤的创伤与缺损一直是危害人类生命的一个严重问题。长期以来，人们不断采用新的材料和方法来解决皮肤缺损给人类带来的痛苦，但是，从简单的纱布到自体皮肤移植，诸多的解决方法都存在一定的局限性。近年来，皮肤组织工程的研究和发展使人们看到了彻底解决皮肤缺损问题的希望。皮肤组织工程支架材料主要有人工合成高分子材料和天然高分子材料。

13．2．3．1　人工合成高分子材料

用于皮肤组织的人工合成高分子材料主要是生物可降解性高分子材料，其特点是在机体环境中可发生生物降解作用。目前，应用最成熟的这类材料是PLA、PGA及PLGA。其最大特点是:可在一定时间内降解;其物理化学性质及生物可降解性、降解产物的可利用特性，对创面成纤维细胞具有一定的生物诱导活性。1992年，H．ansborough研究小组首先制备出PGA生物可降解性网状载体，将来自人类胎儿真皮的成纤维细胞于网状支架上进行培养，然后覆盖在深度皮肤创面上，再将自体上皮细胞移植于其上。此种移植物可诱导新生血管长入，并通过细胞生长、分裂、分化及分泌基质成分，最终形成与真皮性能极为相似的组织层。临床应用发现此组织工程化皮肤移植效果良好，无免疫排斥反应出现。

13．2．3．2　天然高分子材料

用于皮肤组织工程支架材料的天然高分子材料主要有甲壳质及壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素以及其复合材料等。

(1)甲壳质和壳聚糖　甲壳质具有选择性促进上皮细胞生长的独特生物活性，同时它具有动物骨胶原组织和植物纤维组织的双重特性，具有良好的组织相容性，而且还具有广谱的抗菌、止血、止痛的作用，从而成为人工皮肤细胞外基质的理想材料。壳聚糖分子中有许多氨基和羟基，与胶原结合后，有利于上皮细胞的吸附和生长。壳聚糖的纤维刚性结构还可以增强真皮基质的机械耐受力，延缓创面细菌胶原酶对真皮基质的降解。壳聚糖或甲壳质制成的人工皮肤柔软、舒适，与创面的贴合性好，既透气，又吸水，具有抑制疼痛和止血功能，有抑菌消炎作用，随着创面慢慢愈合，自身皮肤生长，能自行降解并被机体吸收，并促进皮肤的再生。从20世纪40年代起就有壳聚糖人工皮肤的研究。周余来等用壳聚糖为基质网架构建组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积全层皮肤缺损进行移植修复，取得了满意的修复效果。

(2)胶原蛋白　胶原蛋白是真皮结缔组织的主要生物成分，具有天然的抗拉、抗张性、低抗原性、良好的生物相容性及完全的生物可降解性，是较理想的皮肤组织工程支架材料。国内在20世纪70年代就研制出胶原海绵人工皮，经动物实验及10家医院在70余个不同类型的烧伤创面试用，证明该产品对机体无毒性和不良反应，能与创面愈合，有保护创面，防止感染等作用。胶原首先被用于创造一种似真皮一样的三维结构以作为细胞生长的基质，Bell将新生儿真皮成纤维细胞与牛工型胶原制成细胞外基质(ECM)，表层附以自体上皮细胞，成为人体创面可接受的人工皮肤。金岩等从5个月胎儿背部皮肤分离表皮细胞和成纤维细胞，将成纤维细胞种植在牛工型胶原凝胶中，培养3天后，将表皮细胞接种在凝胶的表面继续培养，制备人全层组织工程皮肤。其表皮层和真皮层的结构与正常皮肤的结构相似，是一种具有良好生物活性的皮肤替代物，可用来修复全层皮肤缺损。美国FDA 1998年批准的Apligraf就是在胶原基质上接种人活细胞的生物活性的双层人工皮肤，已由Novartis制药公司在美国和加拿大销售，用于烧伤、糖尿病溃疡和皮肤病的治疗。

(3)透明质酸(HA)HA是皮肤组织的主要成分之一，其多方面的生理功能使皮肤保持良好的外观形态，近年来，HA在化妆品中的保湿作用以及对皮肤创伤愈合的作用越来越受到重视。Galassi等将人皮肤成纤维细胞接种在透明质酸苄基酯组成的无纺布骨架上，2周后，在无纺布的生物材料的间隙内能沉积主要的细胞外基质如Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原以及粘连蛋白、层粘连蛋白。将培养的表皮层应用于体外重建皮肤组织中，角质细胞与下面的基质相互作用，通过很好的皮肤表皮结合能形成完整的皮肤等价物。将重建的自体皮肤作为全层伤口(如复合上皮瘤的皮肤切除和慢性深度褥疮溃疡)的临床替代物。皮肤组织没有引起任何不良反应，1～3周后能完全整合并很好的血管化。前者在12个月后发现皮肤具有正常的弹性性能，且没有瘢痕形成的迹象;后者在8周后发现生物材料完全吸收，且在皮肤类组织上有完整的上皮再形成。这个结果表明在透明质酸衍生物骨架上培养的自体成纤维细胞可成功地移植到各种皮肤疾病中，修复皮肤全层缺损。

(4)复合材料　用单一材料制成的人工皮肤虽然在动物和临床上取得了较好的效果，但由于材料本身的性能限制，使这些人工皮肤存在一定的缺陷。许多研究者将多种材料复合，弥补单一材料的缺陷制备复合人工皮肤。

胶原－壳聚糖复合。马列等以胶原－壳聚糖共混物为原料，采用冷冻－干燥的方法构建胶原－壳聚糖真皮支架，动物实验证明它能引导创面组织细胞的长人并能较快与创面组织融合。胡学庆将胶原蛋白和壳聚糖按一定比例混合后采用冷冻成膜——乙醇抽提——真空干燥3步法制备多孔膜，然后再与聚氨酯微孔膜复合制成人工皮肤。目前，许多学者尝试在壳聚糖、胶原等支架材料上种植表皮角朊细胞、真皮成纤维细胞，建立人工皮肤。Ma等研制成了可作为皮肤替代物和皮肤组织工程支架的双层结构的壳聚糖膜和多孔海绵复合材料，膜层可用于像普通敷料一样控制体液渗出，而海绵层则是带正电荷的“脚手架”适宜真皮成纤维细胞的贴附和生长。体外细胞培养实验说明细胞可通过细胞外基质与海绵层紧密结合成为活体－基质－壳聚糖复合物，在培养中，该材料具有形状和尺寸的稳定性，可望取代胶原材料。朱堂友等采用组织工程方法，在鼠尾胶原中加入壳聚糖、6－硫酸软骨素、透明质酸、肝素、弹性蛋白等及培养的人包皮成纤维细胞，制成真皮替代物，随后将小儿包皮成纤维细胞接种于表面，进行皮肤器官型培养，制成含活细胞的壳聚糖－胶原－糖胺聚糖人工皮肤，它由两层构成:分层分化的表皮和成纤维细胞重建的真皮。

胶原－透明质酸复合。已报道在细胞和胶原基质中，加入HA可促进人成纤维细胞的分离。Park等研究了碳化二亚胺交联的胶原－HA海绵基质作为皮肤组织修复支架的生物学性能。将人胎儿皮肤成纤维细胞分别接种在胶原－HA和多孔聚氨酯基质上进行细胞黏附和增殖实验，结果发现:胎儿成纤维细胞对所有胶原－HA基质的黏附均比聚氨酯好，但胶原基质中HA含量对细胞黏附影响不大;胶原、胶原HA基质的细胞增殖与聚氨酯相比，明显提高，尤其是9．6%的HA含量的胶原－HA基质的细胞增殖速度则更加突出;而且HA含量大大增加成纤维细胞从细胞聚集的胶原基质中迁移到其他基质中的数量。但在动物试验中，发现胶原－HA基质与胶原基质对伤口愈合效果没有明显差异。

明胶－透明质酸。明胶是胶原蛋白的衍生物，具有以下优点:在体内能完全吸收;已用作各种伤口敷料。Choi等将明胶和HA复合制成海绵，然后用1－乙基－3－3－二甲基氨丙基碳化二亚胺交联，制成不溶性基质。在Wister鼠背部皮肤上创造1 cm厚的缺口，用明胶－HA海绵作伤口敷料，用凡士林纱布作对照，分别在5天、12天、21天进行观察，组织学结果显示明胶－HA海绵有很好的伤口愈合能力，证明其可作为一种新型的伤口敷料或皮肤组织工程支架。

胶原蛋白－硫酸软骨素复合。Yannas等用一种可以防止体液流失的硅胶膜，在其底层加上由硫酸软骨素和胶原合成的材料作为一种人工皮肤移植于烧伤创面，它可以诱导血管长入和向内产生新的结缔组织;经临床应用证明可以得到较好的疗效和产生新生瘢痕组织。张其清等将分离、培养的成纤维细胞在体外扩增后接种在胶原海绵支架和胶原－硫酸软骨素支架上，制备了两种人工真皮，结构上类似正常真皮，在胶原支架上沉积了大量的细胞外基质，有利于在人工真皮上移植的表皮角朊细胞的增殖、分化和表皮结构的重建，但后者效果更好。这两种人工真皮具有潜在的生物活性和应用前景。美国Integra Life Science公司开发的Integra人工皮肤就是用多孔胶原硫酸软骨素－6真皮取代物作为基质，1996年获FDA批准，1998年获得CE许可证。

13．2．4　神经组织工程

周围神经缺损是外科治疗中的难题之一，由于目前对神经再生的机制还不十分清楚，因此治疗效果差，致残率较高。由于周围神经的再生需要依靠神经膜细胞、基质(膜)和神经生长因子三大因素及其相互之间的作用。因此，在构建人工神经时，不仅要求支架材料不影响周围正常神经的功能，还要求材料能促进神经再生，为神经膜细胞的附着、迁移、增殖和发挥正常功能提供条件。对于人工神经的研究，主要是对材料的研究。近一个世纪以来，研究者们一直在寻找能够替代自体神经移植的组织或物质。目前所研究的材料主要包括生物可吸收材料甲壳质及壳聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白、聚乳酸、聚乙醇酸等和生物不可吸收材料硅橡胶、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚四氟乙烯等。

13．2．4．1　生物不可吸收材料

生物不可吸收材料神经导管可制成无孔导管、多孔导管，并在内部充填血纤蛋白、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和糖胺聚糖。为促进轴索生长，可在管内附着神经生长因子。

(1)硅胶管硅胶管　用于桥接短段的神经缺损，有一定的效果。Fields等研究显示硅胶管桥接短段神经缺损，产生的神经传导速度是正常的60%，在不加入外源性神经生长因子时，其桥接神经缺损不能超过10 mm。Lungborg等应用硅胶管修复3 cm长的尺神经缺损，术后3年，运动感觉恢复良好，小指两点辨别觉达6 mm，表明硅胶管不失为修复周围神经缺损的良好材料之一。

(2)聚丙烯/聚丙烯腈共聚物　Aebiseber应用聚丙烯/聚丙烯腈共聚物，采用干湿相旋转纺丝法制成可渗透性中空纤维管后，修复周围神经缺损，发现此种材料具有良好的促神经再生作用。Levi发现聚丙烯/聚丙烯腈中空纤维管复合体外培养的神经膜细胞修复15 mm长猴肌皮神经缺损，3个月后作组织学检测发现神经膜细胞移植组较胶质体神经移植组稍差，但明显优于血管组。肱桡肌的动作电位检测发现，神经膜细胞移植组和自体神经组相当，空管组未检测到动作电位，表明神经膜细胞移植对神经再生起到促进作用。

(3)聚己内酯(PCL)PCL可制成多孔管状支架。如将PCL溶液中添加葡萄糖粉体制成悬浮液然后制成管状物，用水在室温下沥滤24 h，可制备周围神经修复用的多孔导管。

13．2．4．2　生物可吸收材料

(1)聚乙醇酸(PGA)PGA作为神经导管支架材料已成功用于临床修复短段神经缺损。Malinon应用可吸收的PGA修复15例病人的0．5～3 cm长的指神经缺损，术后平均随访22．4个月，发现感觉功能良好，33%的病人动态两点辨别恢复到3～7 mm，53%的病人恢复到7～15 mm，只有27%的病人恢复较差。Kiyotani等应用干湿相旋转纺丝法将PGA制成中空纤维管，将胶原高温交联于其表面制成可渗透的中空纤维管，修复25 mm长的猫神经缺损，术后5个月组织学和神经元生理检测均表明PGA/胶原管是周围神经良好的修复导管。

(2)甲壳质及壳聚糖　甲壳质及壳聚糖在体内具有良好的组织相容性、无毒性、可吸收等优点，在人工神经的研究中得到了广泛的应用。本作者通过实验研究证明神经膜细胞与甲壳质及壳聚糖具有良好的组织相容性，均可以抑制成纤维细胞的生长。Itoh等分别以甲壳质膜管、自体神经束来桥接修复神经缺损，结果显示甲壳质膜管修复效果较好。于炎冰等用壳聚糖神经导管作为神经再生室桥接大鼠坐骨神经缺损，术后12周再生轴突已长过12 mm的神经缺损间隙，24周时再生完全，导管大部分被降解吸收，再生神经功能恢复良好。李青峰等将壳聚糖制成不同孔径的网状导管支架，再利用肠衣生物膜与壳聚糖制备不同通透性的可缝合的复合神经导管。该导管韧性好、降解时间和支撑强度与神经再生的时间吻合，半通透性允许红细胞、氧气、小分子营养物质通过，局部微环境有利于神经再生及其趋化性的充分发挥，无修复瘢痕。

(3)胶原蛋白　Ⅰ型胶原蛋白是一种天然高分子材料，也是周围神经的主要组成成分。近年来的研究发现，胶原纤维管对神经再生起促进作用。Kim等发现，将体外培养的鼠坐骨神经神经膜细胞混入I型胶原蛋白制成神经膜细胞一胶原凝胶后置入胶原管中，修复10 mm长的坐骨神经缺损，术后3个月做神经动作电位和神经传导速度检测，发现神经膜细胞移植优于自体神经移植组，而髓鞘厚度两者相当。

(4)壳聚糖与胶原蛋白复合　单纯的胶原和壳聚糖作为可吸收材料的报道较多，但单独很难作为理想的神经管材料。我们将两种生物材料共混复合，经过特殊处理后，制备一种新型桥接周围神经缺损的生物材料，并对其进行了相关的研究。在无菌条件下将2%的水溶性壳聚糖在钢模上浇制成长1．4 cm、内径1．2～1．6 mm的神经导管。将壳聚糖和Ⅰ型胶原蛋白分别用2%醋酸配制成1%的溶液，然后以2∶1比例混合，除泡，同上制成神经导管。由于胶原蛋白的韧性可大大增强导管的强度。并以大鼠右侧坐骨神经为实验侧，左侧正常神经为对照，分别用单一的壳聚糖导管、壳聚糖－胶原蛋白导管以及壳聚糖一胶原蛋白导管内置碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来修复鼠坐骨神经缺损。结果显示bFGF能在早期促进神经再生，胶原蛋白对神经再生有一定的促进作用，壳聚糖导管本身是可以修复神经缺损的。显微解剖学观察显示壳聚糖及壳聚糖一胶原蛋白导管在体内的相容性极佳，4周时导管变薄，导管内再生神经纤维整齐、无瘢痕，导管与周围组织无粘连，而导管外侧的神经及肌肉间有明显的瘢痕形成。至16周导管出现明显的吸收现象，管口处已残缺不全。透射电镜观察显示在材料界面上及材料内均未发现淋巴细胞及浆细胞，证明壳聚糖及壳聚糖－胶原蛋白均没有引起慢性炎症反应。笔者与华山医院也共同进行了壳聚糖－胶原蛋白神经导管修复周围神经缺损的研究，通过生物相容性检测结果表明壳聚糖－胶原蛋白复合材料具有良好的生物相容性，动物实验显示胶原－壳聚糖神经导管在植入体内后具有良好的生物相容性，修复神经缺损再生的神经在形态及功能上取得了类似自体神经原位移植的效果，而且没有瘢痕的形成，再生轴突内有丰富的血管形成。与硅胶管相比，胶原－壳聚糖神经导管可为神经再生提供较为有利的环境。从目前的临床应用角度来看，利用可吸收性的导管内置促神经生长因子及营养物质将具有良好的应用前景。

(5)胶原与聚乙醇酸复合　研究者用I型胶原修饰PGA导管后于150℃处理24 h制备人工神经导管。将该导管附着神经生长因子、β成纤维细胞生长因子后用于桥接猫坐骨神经的25 mm缺损。结果表明再生坐骨神经和脊髓及延髓间轴索传输恢复，躯体感觉诱发电位(SEP) 12周后恢复，肌肉运动诱发电位(MEP) 14周后恢复。

13．2．5　肌腱组织工程

用于肌腱组织工程的主要天然支架材料包括工型胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等，但由于这些天然支架材料存在力学强度不足、免疫反应及加工制作引入毒性反应等问题，因此，目前更多的是寻求人工合成支架材料。作为肌腱的主要合成支架材料是PLA、PGA以及两者的共聚物PLGA。由于它们可在体内降解，对人体无毒、无害，已经广泛用于肌腱组织工程学研究; PLGA由于其强度及降解速度可控，机械强度和柔韧性提高，是目前实际应用最有前景的支架材料。为了克服PLGA亲水性差，对腱细胞吸附力差的缺点，研究者将PLGA与胶原复合应用于肌腱组织工程学研究。

生物材料在组织工程中的应用，除了以上介绍的材料的应用外，还有许多的材料和应用，如:聚乙烯类包括聚乙烯、聚苯乙烯及聚四氟乙烯等，由于其良好的力学性能、化学稳定性、无毒、吸水性或透气性很低，可用于制作人工食道、人工气管、人工腹膜和人工心脏瓣膜的支架材料，其中聚四氟乙烯还可制作人工肺;聚氨酯弹性体可制作人工心脏瓣膜、人工血管、人工皮肤、人工肾等;聚对苯二甲酸乙二酯可制作组织工程化血管、肌腱;聚甲基丙烯酸甲酯可制作人工齿科及骨关节材料;聚甲基丙烯酸羟乙基酯可制作人工心脏、人工瓣膜、假牙等组织工程器件;胶原蛋白除了在以上组织工程中应用外，还可用作人工血管、人工肌腱、人工晶体和角膜支架材料等。因此，生物材料在组织工程中的应用有着广阔的前景。

13．3　组织工程支架的设计原则与成型方法

13．3．1　组织工程支架的设计原则

支架是组织工程三要素之一，对细胞的生长以及组织的最终形成起着至关重要的作用。对理想的组织工程支架的设计须满足以下原则:

(1)支架表面允许细胞黏附，促进细胞生长，保持细胞的分化功能。

(2)支架必须具有生物相容性，支架材料以及它的降解产物都不可以在体内引起炎症，并且无毒。

(3)支架必须是生物可降解的，最终在体内消失。

(4)支架必须具有较高的孔隙率来为细胞黏附、细胞外基质的保持提供足够的空间，孔隙结构必须能使细胞均匀地分布在整个支架上来促进组织均一的形成。

(5)支架应具有合适的三维形状。

(6)支架的降解速率必须与组织形成速率相匹配，在组织形成过程中提供足够的力学强度。

13．3．2　组织工程支架的种类与成型方法

目前最常见的组织工程支架主要有多孔海绵状支架与纤维基支架两大类。

13．3．2．1　多孔海绵状支架

多孔海绵状支架主要有以下几种成型方法。

(1)快速成型法　快速成型(rapid prototyping manufacturing，RPM)是组织工程支架致孔和成型技术的一个重要方向之一。将高分子溶液或熔融液体从一个可以三维控制运动的小孔中挤出，再经过凝固可以形成类纤维状物质。快速成型技术的关键是上述过程可以在计算机的控制下进行，在三维成型的同时也得到了有纤维状物质排列而成的规整的三维多孔结构。该方法致孔和成型一体化，易于工业化生产，有很大的优点和很强的前景。但是，如何提高所得到的“纤维”细度、提高孔隙率是该方法面临的一个问题。

(2)粒子致孔法　多孔泡沫或海绵支架是组织工程支架的一种重要类型，可以采用粒子致孔法、热诱导相分离法、气体发泡法和烧结微球法等方法进行。其中，溶剂浇铸/粒子浸出法是十分普遍的粒子致孔法，优点显著。

该方法要采用两种溶剂:溶剂A溶解聚合物，但不可溶解致孔剂粒子;溶剂B溶解致孔剂粒子，但不可溶解聚合物。该方法将组织工程材料和致孔剂粒子制成均匀的混合物，然后利用二者不同的溶解性或挥发性，将致孔剂粒子除去，于是粒子所占有的空间变为孔隙。致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用冰粒子等。最常用的方法是，利用无机盐溶于水而不溶于有机溶剂、聚合物溶于有机溶剂而不溶于水的特性，用溶剂浇铸法将聚合物溶液/盐粒混合物浇铸成膜，然后浸出粒子得到多孔支架。该方法由Mikos等作为纤维连接法的改进而提出，已成功地用于软骨等多种组织工程支架材料。粒子浸出法制得的多孔支架的孔隙率可达90%以上，孔隙率由粒子含量决定，与粒子尺寸基本无关;孔尺寸50～500 μm，由粒子尺寸决定，与粒子用量基本无关;孔的比表面积随粒子用量增大和粒径减小而增大。三者均与盐的种类和溶剂的种类基本无关。

粒子致孔法简单、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，得到了广泛的应用，但致孔时往往需用到有机溶剂。在采用上述方法制备多孔支架时，仅当致孔剂含量超过60%，才有可能使致孔剂完全从支架中脱出。

(3)冷冻干燥法　冷冻干燥法本质上是一种相分离法，并且是一种在冷冻过程中结晶所导致的相分离。用于制备组织工程多孔支架的相分离法将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中水以多个晶核形成冰，与聚合物发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法，按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。

Whang等首先将乳液冷冻干燥法用于组织工程多孔支架的制备。将水与聚合物溶液一起匀化得到油包水乳液，并浇铸到模具中，冷冻干燥脱除水分和溶剂，得到多孔支架。支架孔隙率90%～95%，为相连的孔结构。孔结构的影响因素主要有油水比、聚合物分子量。该法避免了高温，有利于生物活性分子如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放，孔比表面积大，易操作，可制作厚的器件，但孔尺寸偏小。溶液冷冻干燥法用于多孔支架制备时，所得支架孔尺寸往往小于100 μm。有学者通过冷冻过程参数的调控并利用加粗效应制备了孔尺寸超过100 μm的多孔支架，发现孔尺寸的影响因素主要有溶液浓度、冷冻速率和冷冻温度梯度。还有采用改进的溶液冷冻干燥法制备出具有与天然胶原类似的纳米微纤结构的多孔支架，但孔尺寸仍偏小。

冷冻干燥是生物大分子分离的常用手段。冷冻干燥法也是壳聚糖等天然高分子组织工程多孔支架的常见致孔手段。胶原、明胶、藻酸盐、壳聚糖等水凝胶经冷冻干燥均可制得多孔支架。但是亲水性材料支架的力学强度较差，尤其是在体液环境中强度下降是一个值得重视的问题。相分离/冷冻干燥法孔尺寸往往偏小，但该法避免了高温。在皮肤组织工程动物实验中，由冷冻干燥法制备得到的含壳聚糖多孔支架材料已经取得了良好的效果。

(4)超临界二氧化碳等发泡法　超临界二氧化碳法本质上属于气体发泡法，而气体发泡是工业上生产泡沫材料(不限于医用材料)的最常见方法之一。但是工业上的多数气体发泡方法不能满足生物相容性要求。组织工程多孔支架的发泡方法采用了超临界二氧化碳，可避免在制备支架时使用有机溶剂，无溶剂残留(即使有微量二氧化碳残留也无妨)。该法将聚合物压成片，浸泡在高压二氧化碳中直至饱和，甚至超临界状态，然后突然降至常压。气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长，形成多孔支架。但该方法常常得到闭孔结构。发泡法中影响孔隙率和孔结构的因素主要有聚合物结晶性和分子量、平衡时间、放气速率等。结晶性聚合物PLLA和PGA难以发泡，无定型聚合物PLGA易发泡;聚合物相对分子质量越高越难以发泡，孔隙率越低;在高压气体中平衡时间越长，孔隙率越高;放气速率对孔隙率影响相对较小。

除了上述的物理发泡法外，也可用化学发泡法来制备多孔支架，采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液/碳酸氢铵粒子混合物加入到模具中，待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡，最后经冷冻干燥可得到多孔支架。

(5)烧结微球法　烧结微球法所得到的支架相当于通常的盐粒致孔法、超临界二氧化碳法等得到的多孔海绵的“负”模板，有自己的特色。将可降解聚合物微球加入模具中，加热至玻璃化温度以上，保持一定时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架，即为烧结微球法。热处理时微球相互接触处由于链运动而连接在一起，冷却至室温后该结构被固定下来，因而得到多孔的烧结微球支架。微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔，孔尺寸与微球尺寸成正比，孔隙率则随微球尺寸增大略有增加，孔相连性很好。支架压缩模量为241～349 MPa，随微球尺寸减小而增大。该支架的孔隙率与骨松质中组织分率(30%)相近，力学性能也与骨松质相当，因而可作为骨松质修复的“负”模板，修复完成后孔的部分成为组织，聚合物微球部分降解后成为骨松质的空隙。该法优点在于孔相连性好，孔尺寸易调控，力学强度大，缺点在于孔尺寸偏小，孔隙率亦低。

13．3．2．2　纤维基支架

由纤维组成的组织工程支架通常称为“纤维基组织工程支架”，多应用于肌腱和韧带组织工程中。纤维基组织工程支架通常利用纺织技术制备，根据运用纺织技术的种类可以分为以下几类:

(1)纤维束直接作为支架　利用纺丝技术将PGA、PLA等生物材料做成纤维，用纤维束作为支架。Alexander H等用PLA细丝与碳纤维的复合材料作为支架，碳纤维提供组织生长的支架，PLA对降解速度进行调节，这种复合物构架具有较强的抗张特性，但柔韧性差; Cao Y．L．等将从小牛肩和膝部的肌腱组织中获取的肌腱细胞，接种于PGA网状支架上，体外培养一周后植入裸鼠皮下，发现肌腱细胞与材料复合良好，新形成的肌腱在术后12周，抗拉强度为正常肌腱的57%;项舟等用肌腱细胞与碳纤维增强PGA加胶原表面涂层材料体外联合培养后植入动物体内，桥接肌腱断端，观察到肌腱细胞具有增殖、合成胶原的能力，术后4周观察到植入物间胶原纤维组织趋于致密组织结构，有大部分胶原纤维已连接肌腱断端;曲彦隆等制作了梯度降解肌腱支架，梯度降解肌腱支架材料采用医用可吸收高分子聚合物聚二氧杂环己烷(PDS)、聚己酸内酯(PCL)、PGLA三种成分不同时段降解，既为修复后的肌腱提供足够生物力学强度，又能通过逐步降解为肌腱细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生肌腱形成。

(2)编织类支架　编织是一组纱线沿0°方向延伸，而且所有纱线都偏移一个合适的角度，然后交织在一起形成织物的过程。Cooper J等以PGLA长丝为原料，分别采用圆形编织法和矩形编织法制作了前十字韧带支架，并进行了体外研究，研究表明支架在拉力作用下，表现出很短的弹性区域，接着是较长的塑性变形区域，支架的极限抗张强度为100～400 MPa，支架与人体韧带组织的应力－应变曲线相似，在支架上分别接种老鼠纤维原细胞和新西兰白兔前十字韧带纤维原细胞，用扫描电子显微镜(SEM)观察支架培养一周后的形态，发现两者在支架上都能黏附、增殖，前者生长取向是任意的，后者则沿着支架生长。Lu H等分别以PGA、PGLA、PLA长丝为原料，用圆形编织法制作了三种前十字韧带支架，并进行了体外研究，其中PGA支架的最大拉伸强力为(502±24) N，极限抗张强度为(378±18) MPa，PGLA支架的最大拉伸强力为(215±23) N，极限抗张强度为(117±12) MPa，PLA支架的最大拉伸强力为(298±59)N，极限抗张强度为(165±33) MPa，接种细胞能在所有支架上扩散，但是形态和生长方式有所不同。

(3)针织类支架　针织是将纱线顺序地弯曲成圈状并相互串套形成织物的过程，与编织结构相比，针织结构具有更高的孔隙率，能为组织向内生长提供更多的空间。Ouyang HW等以PGLA为原料，采用纬平针结构制作了肌腱支架，并进行了动物实验，在支架上接种细胞后植入白兔体内12周后，拉伸模量可达到正常肌腱的62．6%。

(4)静电纺丝纳米纤维支架　应用静电纺丝技术，将纳米纤维置于针织支架表面和线圈之间，增加了针织支架的表面积，减小了孔隙尺寸，从而不需要用纤维蛋白胶传递细胞。Sahoo S等先以PGLA长丝为材料，制作了纬平针结构的针织支架，然后利用静电纺丝技术制备PGLA纳米纤维，并使其附着在针织支架中。该支架的厚度为0．8～1．3 mm，纳米纤维直径为300～900 nm，初始拉伸断裂强力为(56．3±6．66) N，支架在体外降解14天后，拉伸断裂强力为(1．82±0．6) N。在支架上接种细胞，发现细胞在支架上的黏附和增殖情况良好。

13．3．3　组织工程支架孔隙率的测量

孔隙率是多孔材料的一个极其重要的参量。不同材料和不同的孔径范围有各自相应测量方法。孔隙率的定义为支架孔隙体积占支架表观体积的比率。下面介绍3种组织工程多孔支架孔隙率的测量方法。

13．3．3．1　简单的重量体积法

直接称量出支架的体积和重量，在聚合物本体密度已知的情况下可以得出支架的孔隙率。但是，该方法在不少情况下并不适合使用，支架骨架的密度也未必就是聚合物本体的密度。

13．3．3．2　压汞法

组织工程多孔支架的孔隙率测量可以采用压汞法。压汞法需要特定的仪器，且汞蒸气有毒，故并不很实用。优点是除了孔隙率以外，还能得到孔径和孔径分布。平均的孔直径可以通过WashBurn方程得到。

13．3．3．3　改进的重量法

该方法综合使用了称量瓶和比重瓶。在称量瓶中加入一定量的乙醇，放入干重为Ws的样品，待乙醇充分浸入孔中后称得称量瓶重Wa，将湿样品用镊子轻轻取出后，称量瓶重Wb，则湿的支架重为Wa－Wb，孔中所吸收的乙醇重为(Wa－Wb－Ws)，孔的体积为(Wa－Wb－Ws) /ρ，其中ρ为乙醇的比重。将充满乙醇的比重瓶称重W1，然后将从称量瓶中取出的湿样品放入比重瓶，再次充满乙醇到规定刻度后称重W2，则湿支架排开的乙醇重量为W1－［W2－(Wa－Wb)］，多孔支架的表观体积为{ W1－［W2－(Wa－Wb)］} /ρ，则多孔支架的孔隙率为(Wa－Wb－Ws) /［(Wa－Wb)－(W2－W1)］。

该改进方法的优点不仅在于简单，还在于完全绕过了聚合物、支架和溶剂的密度问题。将乙醇换为其他合适的溶剂不会影响测量结果。

组织工程多孔支架作为细胞外基质的替代物，其外形和孔结构对实现其作用和功能具有非常重要的意义。尽管现有的制备方法和技术在调控多孔支架的外形和孔结构上已取得了很大的进展，但各种制备方法和技术各有其优缺点，尚没有一种方法能同时满足支架的所有要求，往往需要根据对支架的实际要求，将多种方法结合起来才能制备出所需要的支架。能制备出同时具有复杂外形和规则的相连孔结构的多孔支架的制备方法和技术将是今后组织工程多孔支架制备方法和技术研究开发的方向。