第12章　生物材料表面改性及表征

生物材料的生物相容性是其特有的、也是苛刻的要求。材料植入体内以后，首先是其表面部分与细胞直接接触，材料与细胞相互作用首先表现在材料表面与细胞的相互作用。此外，使得支架的原材料满足生物材料的众多要求是一件很难做到的事情，但是相比而言，在体材料的基础上进行表面改性则为一个较为实际的途径。研究细胞与生物材料的相互作用，并在此基础上提出实用的表面改性技术是一个重要课题。

表面改性技术与表面科学密切相关，其本身并不限于生物医用材料。医用材料的表面处理也在很大程度上得益于一般意义上的聚合物材料的表面技术。

12．1　聚合物固体表面处理方法概述

一般意义上的高分子固体材料的表面处理目的如下:①提高材料的被黏结性或可印刷性、可电镀性;②提高对物质或能量的选择性屏蔽或改变材料的通透性;③提高材料的硬度和耐磨性;④提高材料的耐化学药品性;⑤提高材料对生物体组织及生物功能的适应性。

普遍的聚合物固体表面处理方法大体上包括化学方法和物理方法两大类。

12．1．1　化学方法

(1)溶解处理或表面活性剂处理　净化表面、选择性地除去低聚合度成分是一种简单实用的表面处理手段;表面活性剂处理也会显著改变材料的表面性质，尤其是亲/疏水性。

(2)表面涂覆　可以直接在支架表面涂覆具有所需要性能的高分子材料，也可以先涂覆多官能团的单体或预聚物，然后再固化。

(3)浸蚀剂处理　该方法是改善材料亲水性的一个常用方法，在浸蚀剂中处理之后，表面发生氧化，增加了材料的亲水性。

(4)偶联剂处理　在材料表面添加偶联剂，以导入活性官能团，通过进一步反应可以改变表面性质。

(5)接枝处理　在固体材料表面接枝高分子链是聚合物材料表面改性的常用的重要手段。

12．1．2　物理方法

(1)电子束、紫外线照射处理直接采用电子束或紫外线照射，有时是一种简单有效的方法。

(2)低温等离子体处理在辉光放电、电晕放电等过程中可以产生等离子体流，其活性很高，可以显著地改变材料的表面性质。

(3)等离子体聚合如果在材料表面引入单体，在等离子体作用下使其聚合，并在表面形成所预期的不溶物质，也可以作为表面改性的一种选择。

(4)高能重离子注入采用当代物理技术的成就，对材料表面注入高能重离子，有时会产生奇妙的效果。

(5)金属化处理采用电镀、喷镀、离子喷涂等方法形成金属薄膜，也可以达到表面改性的目的。

当然，上述物理方法和化学方法的划分并不是绝对的，如等离子体聚合也可以被视为化学方法。综合采用化学方法和物理方法有时也是一种解决方案。

12．2　组织工程用高分子材料表面改性的主要手段

大多数哺乳动物细胞为贴壁型细胞，需黏附在基质表面才能生长。细胞能够在材料表面黏附、黏附后的细胞在材料表面能很好地增殖和分化的性质称为材料的细胞亲和性。大部分高分子材料本身的组织相容性并不理想，疏水性的可降解聚酯等许多材料本身不利于细胞的贴壁生长，故必须对生物材料进行表面处理。组织工程材料的表面改性的首要目的就是为了促进细胞黏附。下面以聚酯类材料为例，介绍高分子多孔支架内表面修饰的主要方法。

12．2．1　简单浸泡法

对于由聚酯组成的支架，在碱液中浸泡本身就可以在一定程度上达到提高细胞黏附性的效果，主要原因为:聚酯支架在碱液中浸泡后，表面的聚酯发生了显著水解，露出了较多的羟基和羧基，从而提高了材料的亲水性;此外，腐蚀的结果导致表面粗糙度上升，也有利于细胞黏附。另外，在消毒时所采用的乙醇，能够适度提高聚酯的亲水性，也在一定程度上提高了细胞黏附性。

12．2．2　表面涂覆法

将一些可导致细胞黏附的合成或天然高分子涂覆到材料表面，是一种简易实用的方法，其中，使用胶原等天然材料对合成材料进行表面改性是较为成功的方法。通过物理吸附也可在聚乳酸类支架材料表面引入反应性基团或多肽序列。聚赖氨酸已广泛地用于细胞培养，将其涂覆在支架内表面上，通过静电作用可改善细胞黏附能力。

12．2．3　化学反应法

鉴于表面涂覆法得到的涂层在组织培养液中会有不同程度的脱落，人们考虑直接将某些目标分子通过化学反应接到材料的表面。该方法的步骤为:在材料表面制出可进一步反应的化学活性基团，再通过化学或辐射等方法将与细胞亲和的高分子链接枝于原有固体高分子材料的表面。从材料科学的角度看，这里的关键往往是制造出反应性基团。通过表面水解或等离子体处理可在支架材料表面引入反应性基团，如氨基、羟基、酰胺基、羧基、磺酸基等。也可以合成含反应性基团的单体，再共聚合成新的聚合物以引入反应性基团。

在材料表面制造可进一步反应的化学活性基团，可将精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(RGD)等活性短肽共价连接到材料表面。在组织工程支架材料本体或表面引入官能团、多糖、蛋白质或多肽，可促进支架表面与细胞之间的选择性相互作用(配体－受体键合分子生物模型)，并控制细胞的反应。另外，含官能团聚合物支架可更好地模拟天然的细胞外基质支撑细胞、与细胞作用的功能，并产生更自然的宿主反应。将细胞黏合多肽物理吸附或化学接枝到生物材料表面，可显著改善支架对细胞的黏合性，是广泛应用的表面改性方法。其中，RGD多肽序列存在于许多细胞外基质蛋白中，是整合素(细胞表面的一种受体)的主要黏合点; REDV对内皮细胞有特定黏合作用，在心血管组织工程上将有很好的应用前景。

12．2．4　物理截留法

物理截留法的效果与直接化学接枝法一样，都是将某些高分子链牢固地连接在固体材料表面，但巧妙地采用了物理方法予以实现。该方法依赖于一种合适的溶剂，既能够部分溶胀支架材料，又能够完全溶解用来接枝的高分子。这样，这些高分子就会部分渗入处于溶胀状态的支架材料表面。一旦支架在不良溶剂中完全固化，则部分高分子必定被“截留”在支架表面。该方法会显著地增加材料表面的粗糙度。

12．2．5　等离子体处理法

等离子体为物质的一种状态。物质在高真空或强电场、高温、激光等作用下，中性的原子或分子失去电子，电离成为流动性强的离子(气态离子)或分解为自由基，因其包含的正电荷和负电荷相等，称为等离子体。有人将自然界物质的状态分为气体、固体、液体和等离子体4种。等离子体具有很强的反应性，可以进行表面反应、沉积/聚合、蚀刻/消融等。医用材料的表面改性一般采用低温等离子体。等离子体处理以后，材料表面的化学基团以及亲疏水性等会发生明显变化。

上述方法可以综合使用，例如，PLL也可牢固地吸附在PLA表面，即使经多次洗涤仍可保持住，因而可在PLA表面引入反应性基团。将GRGDS通过偶联剂连接到PLL大分子上，再利用PLL在PLA表面的物理吸附作用，可在PLA表面引入RGD序列，改善和控制细胞黏附。该法适用于多种组织工程支架材料的表面改性。

12．3　影响细胞黏附性的因素

除了相连通的多孔结构、合适的孔尺寸、高的孔隙率和大的表面积外，组织工程多孔支架的表面理化性质(功能基团、极性、电荷等)和形态(粗糙度等)对细胞亲和性有很大的影响。支架表面的化学基团对细胞的黏附和生长有很大的影响，合适的表面化学基团能有选择地吸附环境中的黏附蛋白作为细胞识别位点，增强对细胞的黏附性。孔壁表面粗糙也有利于细胞黏附。

成功的表面改性所需要的指导思想依据于人们对于细胞黏附或不黏附的机制的认识。遗憾的是，目前细胞在各种材料表面黏附的机制并不是十分清楚。但是，人们通过实践已经在一定程度上总结出影响细胞黏附性的部分因素。

(1)表面粗糙度　一般说来，粗糙的表面容易导致细胞黏附，所以组织工程多孔泡沫的内表面粗糙是有利的;而抗凝血材料则一般要求表面十分光滑。生物材料表面的拓扑形貌还会影响细胞的迁移和取向等，应引起重视。

(2)亲疏水性　这是十分重要的因素。疏水表面更容易导致蛋白质的非特异性黏附和变性。一般说来，过于疏水的表面不利于细胞黏附;但是过于亲水的表面也不见得利于细胞黏附。究竟什么是最适宜的范围，目前尚不能给出一个定量的判据。

(3)荷电性　在中性pH条件下，材料表面的电荷是一个重要的因素。由于细胞表面也带电荷，荷电性的影响本身是易于理解的。一般来说，对于组织工程材料，表面带正电荷较为有利;而对于抗凝血材料，则表面带负电较为有利。但是光凭一个因素，尚不能对材料的细胞黏附性给出准确的预言。

(4)预先吸附的表面蛋白质的构象　一个值得注意的重要问题是，细胞往往不是直接黏附在原来的材料表面，而是材料表面先吸附一部分蛋白质等细胞外基质成分和培养液成分，然后再与细胞作用。所吸附的物质的性质，如蛋白质的构象，会最终影响细胞在材料表面的行为和生物材料的实际治疗效果。

(5)仿生基团　细胞外基质中的一些成分(如纤维粘连蛋白)有很强的导致特异性细胞黏附的能力。其中，关键是一些短肽序列在发挥作用。体液中还有其他的活性物质有特殊的促进或阻碍细胞黏附的功效。如果从分子设计和材料表面工程设计的角度将上述物质或仿生基团连接在材料表面，则会导致生物材料的功能大大提高。

(6)表面图案　这里所谓的图案不仅仅是表面的微观高低不平所导致的拓扑形貌，还特别包括由于材料表面活性基团的空间分布以及材料表面物理化学性质在微观上的规则反差所导致的细胞响应，是一个曾经被忽视的重要因素，它对于细胞的黏附、迁移、增殖和分化等均有显著影响。

对于一个具体的问题，往往不是单一因素在起作用，有时候多种因素还可能协同作用，要综合考虑。生物材料的仿生化是一个方向。上述影响因素可以从仿生的角度部分获得理解。尽管组织工程多孔支架的表面改性有利于细胞黏附，但有研究表明，有时在引入多肽的材料表面培养细胞时，细胞外基质的合成却反而减少。可见，表面改性后的生物活性材料对细胞和组织的生长将产生复杂的影响，相关的研究必须进一步深入进行。对于组织工程材料而言，不仅希望细胞在材料表面黏附，还要易于迁移，能够增殖，有时还希望定向分化。生物材料以及其他培养环境为细胞所造就的力学环境也在很大程度上影响细胞行为。而细胞分泌出大量的细胞外基质之后，这些细胞外基质会与生物材料复合形成实际的胞外环境。随着材料的逐步降解和细胞外基质的逐步分泌，该实际的动态组成还在发生变化。深入研究细胞与生物材料的相互作用，并提出生物材料新的设计原理和改性方案仍然是一个重要的课题。

12．4　血液相容性材料的表面处理方法

组织工程支架材料表面处理的目的是为了提高细胞的黏附性，而许多心血管材料为了改善其血液相容性，则希望通过表面处理，使得血小板等细胞不易在材料表面黏附和导致凝血。不同医用材料的表面处理方法的基本原理大致相同，但是为了不同的目的会采取不同的措施。组织工程材料表面接枝或涂覆RGD、胶原、纤维粘连蛋白等以提高细胞黏附性。血液相容性材料的表面则会接枝PEG等分子以降低血细胞的黏附性。抗凝血材料表面修饰的手段可以分为两大类，使材料表面显现生物惰性，或者主动控制高分子材料表面与血液的相互作用。

12．4．1　生物惰性表面

除了一般要使得材料表面十分光滑以外，还可以采用以下方法使得血浆蛋白质不易被吸附到材料表面、血小板不易黏附或凝血途径不易被活化。

(1)接枝聚氧化乙烯(PEO)，这是一个重要手段。接枝了PEO的表面由于蛋白质的非特异吸附被阻断从而后续的凝血也难以发生。

(2)构造荷负电的表面材料的荷电性会影响其血液相容性，带羧酸根的聚氨酯确有较好的抗凝血性。但是，凝血是一个复杂的过程，尚有许多不确定因素。针对具体材料仍然要靠实验的结果。

(3)产生适度微相分离的表面，对于聚氨酯材料，微相分离结构将影响其抗凝血性。

12．4．2　仿生的材料表面

人体在自身正常的环境下是不会发生凝血的。如果材料表面能够仿人体内部的某些环境，则会起到奇妙的结果。(www.daowen.com)

(1)磷脂修饰法从仿生的角度来看，如果在材料表面接枝或涂覆磷脂，可以仿细胞膜，从而可能起到抗凝血功能。

(2)负载生物活性分子接枝或涂覆生物体内本已存在的生物活性物质是一种重要的仿生手段。肝素是体内所具有的一种多糖，可以催化和增强抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的结合，能十分有效地抗凝血。接枝肝素也就成为一种常用手段。此外，也有利用白蛋白、前列腺素等提高材料抗凝血性的成功实验。

(3)构造细胞底层血液相容性材料表面改性的一个独到方法是在材料表面预先凝血甚至预先种植内皮细胞。当血管内皮细胞能够成功地被种植在人工血管的内表面，则植入物的抗凝血性能会显著提高。

12．5　抗凝血材料表面处理有效性的机制探讨

除了种植内皮细胞这样的手段以外，其他方法的有效性尚无十分确凿的、统一的理论解释。目前并不清楚哪种因素是决定性的、且适用于所有或绝大多数场合。现有的部分代表性解释如下。

(1)立体排除　该解释主要针对表面接枝PEO的抗凝血效果而提出。PEO或PEO亲水性很强，不带任何电荷，并且能够阻止蛋白质在材料表面的非特异性黏附，是十分重要的防止细胞黏附的大分子。一些人认为，亲水的PEO链在水中为高度伸展的无规则线团，当相对紧致的蛋白质靠近PEO无规线团时，会迫使该线团压缩，从而使构象熵降低，产生了抵抗蛋白质吸附的黏弹性。除了上述热力学排斥的解释以外，还有人认为PEO链高度柔顺，有很高的运动性，使得血浆蛋白质无足够的时间接近材料表面，导致动力学壁垒。但是，为什么PEO要比其他大多数水溶性高分子有效，目前尚不能圆满解释。

(2)静电排斥　细胞的外层一般包裹着透明质酸等带负电的物质。如果材料表面带正电，则有利于细胞接触;反之，如果材料表面带负电，则不利于细胞接触材料的表面。按照此解释，抗凝血材料应为负离子型。

(3)维持构象　该解释认为，既然凝血反应过程总是伴随着血浆蛋白质的变性，如果材料的表面能够维持介质中蛋白质的正常构象，则可以抑制凝血。

(4)覆盖控制　细胞黏附基于聚焦接触，细胞膜上偶联细胞骨架的受体要与材料表面的给体结合方能激发细胞黏附现象。而上述聚焦接触对于基团的空间分布有成簇的要求。如果材料表面发生微相分离，且不利于细胞膜上某种受体蛋白质的凝聚，则细胞黏附将不会或不能很好地发生。对于心血管材料，则可能起到抗凝血的效果。

12．6　医用高分子材料表面理化性质的常用表征方法

材料的表面改性研究工作离不开对于材料表面的表征。除了直接动用扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)等显微手段对于材料表面的形貌直接观察以外，医用高分子材料表面理化性质的定量表征方法还有接触角法、反射式红外光谱法和表面光电子能谱法(XPS)等。接触角只是为了考察表面的亲水程度，表面红外光谱是为了验证改性以后材料表面的特征及化学官能团的变化，而XPS可以用来进行材料表面的化学元素分析等。

12．6．1　接触角

将液滴放在一理想固体平面上，则接触角是气－液界面通过液体而与固－液界面之间的夹角。接触角测量仪的原理十分简单。只要设计一个注射器，向材料表面滴加液体;同时，运用电荷耦合器件(CCD)技术或直接的光学显微镜观察，并以程序或简易测角的辅助装置就可以得到接触角。需要指出的是，接触角的测量或CCD图像的获取要在一定时间范围内完成，如滴加以后30 s以内获取图像。实验发现，随着液滴的挥发，接触角会有所变化。从理论上讲，液滴大小本身对于接触角并无影响;估计这是由于材料中和(或)大气中一部分小分子物质溶解在液滴中改变了液体的实际组成，更可能是由于部分液体渗透到了固体材料表面，改变了界面张力。

以上仅介绍了最普通的测量静态接触角的淌滴法。鼓泡法是另外一种方式，即首先将固体材料全部浸在液体之中，然后采用针头在材料的下表面推入气体鼓泡，同样可以测量接触角。两种方式测得的角度一般会有所差异，因此，同样方法得到的角度之间才有良好的可比性。在考察生物材料的亲水性时，淌滴法测量得到的接触角主要反映了聚合物/空气界面的亲水性;而鼓泡法测量得到的接触角则主要反映了聚合物/液体(水)界面的亲水性。由于植入材料最终在体液环境之中，鼓泡法测量更有意义;但是淌滴法也能接受，且被大量使用。

如果将材料倾斜，则液滴在斜坡前后的接触角会有所不同，到了一定角度还会滚动。动态接触角更加复杂。此外，以上述接触角的实验为基础，还能够计算表面张力等参量。对于植入材料，一般还是采用静态接触角比较材料表面亲水性的工作为主。

12．6．2　表面红外光谱

红外光谱是一种振动吸收光谱。化学键的振动有本征方式，对应于本征频率，一般处于红外光的范围。当多色光入射时，分子会吸收与本征频率对应的光线并发生能级跃迁。由于不同的官能团对应于特征的红外吸收，故红外光谱是十分常见的表征有机分子结构的手段。目前，傅里叶光谱技术已经普及，两维光谱和红外偏振光谱在一些场合也有独到的应用。

红外光谱可以采用透射式。但是对于固体材料表面分析，则绝大多数情况下必须采用反射式。表面红外光谱一般就是指反射式红外光谱。

在反射式红外光谱中，内反射光谱法较为普遍，信号的质量较好，适用范围也较宽。该方法采用了衰减全反射(ATR)。如果样品可以做得比较平整，建议采用ATR法。如果无特殊说明，目前医用材料表面红外光谱大多数为衰减全反射—傅里叶红外光谱(ATRFTIR)。漫反射红外光谱法可以研究粉末样品。对于吸收特别强烈的物质可以采用反射—吸收光谱法。在生物材料的表面改性工作中，常常运用表面红外光谱证明所需要接枝的有机分子已经被连接到了材料的表面。

12．6．3　表面光电子能谱

光电子能谱的基础是光电效应。具有一定能量的光子入射并与样品中的原子相互作用时，如果单光子将它的全部能量交给原子的某个壳层的一个束缚电子，且光子的频率大于截止频率，则电子可以克服结合能溢出原子成为光电子，多余的能量即为光电子的动能。如果固定光子的能量，则光电子的动能反映了原来处于束缚状态时的结合能。采用电磁场将具有不同动能分布的光电子分开，即为光电子能谱。显然，光电子能谱反映了材料的表面元素性质。由于X射线的能量范围十分合适激发光电子，故表面光电子能谱一般称为X射线光电子能谱(XPS)。当入射光与材料平面的夹角变化时，可以考察不同的表面深度的元素分布。每种元素所对应的原子的壳层结构尤其是内壳层结构是相同的，在XPS图谱上出现了指纹区，因此，表面XPS提供了极好的对于固体材料表面进行元素分析的手段，且灵敏度很高。例如，对于可降解聚酯等以碳、氢、氧为主的有机高分子材料表面涂覆或接枝胶原、壳聚糖等天然材料或连接RGD等小肽以后，由于有时表面所连接的新物质的量很少，很不容易再次取下来运用常规的分析化学手段定量分析，则通过XPS寻找氮元素的指纹区提供了一个良好的半定量判断接枝是否成功的方法。

原子内层电子的结合能会随着化学环境而变化，存在化学位移，因此，XPS还提供了价态分析和分子结构分析的一种方法，可以与表面红外光谱相互补充。

12．7　生物材料表面改性效果的细胞实验验证方法

医用材料表面性质的好坏归根到底要靠生物学实验来检验。

12．7．1　细胞形态的直接观察

12．7．1．1　普通倒置光学显微镜观察

活细胞形态常常在倒置显微镜下进行。光学显微镜的被观察样品必须在物镜的焦平面上，而显微放大镜头的焦距一般很短。大多数显微镜的物镜在样品台的上方，这样细胞培养板就无法直接放在载物台上观察。为此，发明了倒置显微镜。所谓倒置，是指物镜在载物台的下方，这样细胞培养板可以放在载物台与聚光镜之间，而这个距离是比较大的。当然，由于物镜焦距的限制，细胞培养板的厚度受到了限制。即使对于倒置显微镜，一般还是希望动用长焦距物镜。由于细胞的透明性很高，通常需要在显微镜光路中插入相板，使其成为相差显微镜，以增加细胞与液体介质之间的反差。因此，倒置相差显微镜是细胞观察的必备仪器。

细胞黏附与否在形态上是有所体现的。一般说来，不黏附的细胞呈球形，有时还会成簇聚集在一起。对于贴壁型细胞，当细胞在材料表面良好黏附时，会在材料表面发生铺展，从倒置显微镜下所观察到的两维形态也往往发生改变。细胞在种植之前处于悬液之中，一般呈圆形。通常情况下，细胞在材料表面培养一段时间后如果不呈圆形，则说明材料具有黏附的表面。此外，不黏附的细胞也容易死亡，会漂浮起来。因此，细胞形态的初步观察是判断材料改性效果的重要一环。当然，这些非定量的观察带有一定的经验性。

12．7．1．2　荧光光学显微镜观察

观察细胞时经常需要动用多种染色方法，十分有用。细胞的荧光染色有时很有必要。已经有多种荧光染色法和较为成熟的荧光染料。对于活细胞观察，有一种荧光染料的设计十分巧妙，这就是荧光素二甲酯。该染料由荧光素和一疏水基团共价连接而成，本身不发光。但是在疏水基团的引导下可以穿过细胞膜;在细胞质中由于酯酶的作用而释放出荧光素，从而能够发荧光。而荧光素则不能穿过细胞膜回到细胞的外面。这样，虽然荧光素二甲酯加在细胞培养液中，但是只有具有细胞膜完整性和细胞内酯酶活力的活细胞被染色。

12．7．1．3　其他的部分显微观察手段

荧光染色对于普通的倒置光学显微镜观察属于锦上添花，但是对于激光共聚焦显微镜则为必备的前提条件。激光共聚焦显微镜利用了载物台和物镜之间的Z方向的程控扫描，可以在短时间内获得多个焦平面上的二维剖面图像，并通过图像处理技术重构出三维图像。上述图像的获取属于“无损检测”，细胞可以处于培养液之中。这就提供了一个活细胞观察的CT技术，有很独到的作用。观察材料表面的细胞还可以动用扫描电镜。普通的扫描电镜下，细胞表面的清晰度可以很高，但是只能观察死细胞，且要逐级脱水固定，细心制样;否则，细胞过早破裂，所看到的图像已经不能反映活细胞的形态。

原子力显微镜原则上也可以用来观察细胞。如果采用水相观察，原则上可以看到活细胞。同理，环境扫描显微镜也可以用来观察水相中的细胞。但是，由于细胞尺度本身在光学显微镜的范围，如无亚细胞尺度的观察必要，一般还是动用倒置光学显微镜为宜。

12．7．2　基于细胞计数的定量测量方法

利用倒置光学显微镜，可以在血细胞计数板上对细胞进行计数，并进一步得出一些重要的参量。

12．7．2．1　活细胞率

细胞在材料表面培养以后，可能出现一部分细胞死亡。尽管死细胞在形态上与活细胞还是有些区别，但是单靠形态观察是不够的。采用对活细胞或死细胞选择性染色的方法，可以得到活细胞率。一般采用台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等染料，其中以台盼蓝染色鉴别死细胞最为常见。细胞死亡或损伤以后，一些染料可以穿透破损或变性的细胞膜，并与解离的脱氧核糖核酸(DNA)结合从而着色。正确使用台盼蓝后，死细胞变为蓝色，而活细胞拒染，从而可以通过计数得到各自的数目。

12．7．2．2　细胞黏附率

生物材料表面细胞黏附率测量的参比为用于细胞培养的聚苯乙烯(TCPS)。将生物材料放在细胞培养板中，并在上面接种和培养一段时间以后，吸出培养液，并用磷酸盐(PBS)缓冲液洗涤3次以去除未贴壁细胞;每孔加入定量的胰酶消化一定时间，用枪头轻轻吹打以得到细胞悬液。在倒置显微镜上用血细胞计数板进行计数。在同样条件下，可以得到在TCPS表面的细胞黏附数。

12．7．2．3　细胞增殖率

同理，可以计算出细胞的增殖率。所得到的细胞增殖率也可以和阳性对照(一般为TCPS)及所选择的阴性对照进行对比。

12．7．3　细胞总活力

细胞总活力的测量采用著名的噻唑蓝(MTT)法。MTT是一种能够接受氢原子的染料。MTT能进入细胞，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原成为一种难溶的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞之中。该结晶体可以溶解在二甲基亚砜(DMSO)之中。这样采用普通的分光光度计或酶标仪可以由比色法测出结晶物的浓度，也就间接地知道线粒体中琥珀酸脱氢酶的总活力，从而作为细胞总活力的度量。光密度OD可以采用分光光度计或酶标仪来测量。细胞中酶相关的比色法测量常常采用酶标仪，可以快速地对于细胞培养板的多个培养孔进行测量。分光光度计的光线从比色皿的侧面通过，而酶标仪的测量光线从培养板的底部穿过，会导致两者在数据影响因素方面的某些不同，应引起注意。

实际上，分光光度法总是存在参比问题。一般用酶标仪测量所采用的参比为同一细胞培养板上的另一个空白培养孔(除了无细胞以外，其他MTT测量操作照样进行)。通常参比可以是培养液。有时要注意生物材料自身与MTT试剂反应的问题，故参比也可以是在培养液中的生物材料。

以上所得到的OD值无法与细胞活力直接画等号。如果以TCPS的培养结果作为对照，则有时更有说服力。

12．7．4　生物大分子总含量测定

测定细胞中某些重要的生物大分子的总含量是一个有效的考察细胞培养效果的指标。

总DNA含量。细胞的DNA总含量与细胞数量基本成正比。测量DNA含量可以采用Sigma公司的试剂盒。其核心成分为Hoechst 33258，为可与DNA特异结合的灵敏荧光染料，360 nm激发，460 nm测量。需要作标准曲线。

总蛋白质含量。蛋白质的总含量在一定程度上体现了细胞的活力。可采用二辛可酸(BCA)方法测量。该方法利用了蛋白质的缩二脲反应测量细胞内的亚铜离子浓度。螯合产物为紫色。同样需要作标准曲线。

碱性磷酸酶活力。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的特征酶。可以采用商业试剂盒，测量酶解所得到的对硝基苯酚的含量可以间接地得到酶的总活力。

Ⅱ型胶原。Ⅱ型胶原不如I型胶原常见，但它是软骨细胞分泌的细胞外基质的特征。测量其含量可以在一定程度上为软骨细胞验明身份。同样采用商业化试剂盒。