第6章　量子点在荧光成像和光电传感中的应用

随着纳米技术和各学科之间的进一步渗透，作为一种新兴的纳米材料，QDs的应用研究已经发展成为一个涉及多个学科的交叉研究领域。QDs独特且优异的荧光特性和生物相容性，使其在荧光成像和荧光传感方面展示出潜在的应用前景，得到了许多非常有意义的结果，在生命科学和分析科学中发挥了越来越重要的作用。同时，量子点还具有独特的电化学及电致化学发光性质，基于量子点的电化学传感也引起了广大科研工作者的兴趣，因此，本章主要对量子点在荧光成像和光电传感中的应用进行综述。

6．1　量子点在荧光成像中的应用

生命科学的飞速前进离不开新技术新方法的应用。荧光显微成像技术出现后，人们对于细胞内精细结构、细胞间相互作用、细胞信号转导及大分子蛋白的作用有了更深入的了解。研究人员不断致力于新的荧光成像技术和荧光探针的开发和研究，但有两大难题一直横亘在探索的道路上:一是无法有效地克服细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖;二是由于荧光有机染料分子易发生光漂白，无法较好地实现对所研究分子的长时程荧光标记观察，这就迫切需要出现一种有强大的、持续的荧光效应能掩盖细胞的自发荧光且具有抗光漂白作用的新的荧光物质。量子点的许多光学特性恰可以解决这两个问题，而且其尺寸特点也使得它非常适于在生物荧光成像中做荧光标记物。量子点的出现特别是其在生物学中的应用给生命科学众多领域的研究带来了曙光，也已成为研究的热点之一。

6．1．1　活细胞荧光标记及组织光学成像

细胞生物学中一个重大的突破就是活细胞成像。细胞或细胞组分成像的标准方法是用荧光物质对相关部位进行标记，量子点作为纳米尺寸的晶体，有着独特的光化学和光物理学特性，使其不仅适合单分子成像，也可以进行组织整体的成像研究。量子点标记技术在初期已被广泛应用在固定细胞的荧光成像方面，而活细胞成像中大多局限在细胞膜受体定位和细胞质的研究中。Chen等首次将量子点与标记分子复合物通过转染进入细胞核，在实验中他们将量子点与SV40(猴病毒40)大的T抗原核定位信号(NLS)结合，并经转染进入活细胞，通过荧光成像系统监测到复合物从细胞质到细胞核的运动过程，经一周以上时间的培养观察，没有发觉对细胞有负面影响。长时间观测可以看到复合物堆积在细胞核中。这一工作首次将量子点用在细胞核中进行长时程观测生物现象，提供了一种新的无细胞毒性成像技术来研究细胞核的交换机制及过程，使细胞核的研究工作提高到可视化程度。量子点颜色的可调性，使其可实现同一细胞的多色标记。有研究表明，可同时用发红色荧光的量子点标记细胞核，发橙黄色荧光的量子点标记高尔基体，发绿色荧光的量子点标记微管，经单一波长的光激发后，3种颜色同时显现，这是常用的标记物和荧光染料所无法做到的，足以可见量子点生物应用的广阔前景。

量子点在活细胞成像中的应用除细胞核外，还被用于细胞内源蛋白、表皮蛋白、细胞内组分及细胞内外受体运输途径的研究。量子点进入细胞的途径也可以不经修饰而通过转染技术，由磷脂脂质体包裹直接进入，这种技术增加了量子点的水溶性和生物兼容性;脂质体中的量子点非常的稳定，甚至经过90 min的光照射后荧光强度仍保持在正常的数量级。这种脂质体包裹的量子点除了在活细胞中应用外，还可以用于组织和生物大分子中。

组织光学成像是量子点的另一大优势。水溶性量子点外包被生物分子增加了其生物兼容性，可使量子点进入组织进行长时间光学成像，这是众多荧光染料分子所不能比拟的。由于血脑屏障的存在，脑组织中荧光可视成像一直是神经科学研究的难点，量子点却可以突破这个屏障进入脑组织。如量子点与TAT(一种细胞敏感的缩氨酸)连接后，通过动脉进入脑内，几分钟内就标记到脑组织上而不受血脑屏障的影响，用低功率的紫外灯就可以使整个鼠脑的荧光清晰可显。组织学数据显示，除了内皮细胞外，TAT连接的量子点都可到达脑组织，未连接TAT的量子点则不能进入。这一实验证实量子点进入脑组织成像是完全可能的，这为脑内药物靶向递呈研究和神经科学及开发人工智能提供了强有力的工具。

量子点活细胞标记成像技术不仅可以用在动物细胞和组织中，还可用于植物细胞中。Ravindran等将与花粉黏着素(SCA，一种花粉管黏着蛋白质)结合的量子点加入到已发芽的百合花花粉颗粒中，在共聚焦显微镜下，对这种蛋白质首次进行了定位观察，为量子点的应用开阔了新的领域。

量子点在活细胞荧光标记及组织光学成像中的应用，使我们更深入地了解到不同种类细胞的内部结构、分子运行轨迹及深组织形态学，为生理学研究、药物靶向载体的开发提供了一种新的途径。

6．1．2　肿瘤细胞示踪及诊断影像

肿瘤及癌症的诊断和治疗问题是全世界都在关注的焦点。光学成像技术在敏感的肿瘤诊断尤其是在肿瘤的早期诊断阶段有着巨大潜力，这是一项灵敏的、非侵入性、非电离性、临床应用安全、花费相对便宜的技术。在肿瘤转移的研究中，Voura等通过量子点标记和多光子激发、光谱成像，观察到了肿瘤细胞转移到肺组织中的5个入口。

子宫颈癌作为高发肿瘤之一，世界各国都在积极开发早期诊断及治疗的方法。目前，量子点已经可成功地使之应用在细胞水平的肿瘤成像上。Nida等将与量子点连接的表皮生长因子受体与抗生长因子抗体形成共轭对来探测子宫颈癌前期生物学标志物，经过适当地控制，观测到准确标记的生长因子受体，结合光学成像技术，显示子宫颈癌在分子水平的变化。该技术有助于肿瘤早期的诊断。

量子点还可用于检测肿瘤的血管变化。肿瘤组织周围血管丰富，细胞生长迅速。通常所用荧光试剂不能实时对多种组织成像，而多色量子点标记技术可以应用到肿瘤细胞、肿瘤血管及周围区域的边界研究中，从而应用于肿瘤早期诊断和治疗。Stroh等将量子点、多光子成像技术和表达绿色荧光蛋白的转基因老鼠结合研究肿瘤血管周围的细胞和组织。结果证实这些纳米荧光晶体可以实时成像，并可从血管周围的细胞和组织中区分出肿瘤血管。他们还利用量子点标记成功地检测到了干细胞由骨髓补充到肿瘤脉管系统的过程，这为多功能的量子点用于肿瘤病理生理学研究开辟了一条道路。

近红外荧光由于能穿透组织进行深层组织成像且自发荧光背景较低，已引起有关研究者的注意，且已将其引入到肿瘤研究中。发射近红外荧光的量子点已经被制备出来，并用于多种疾病的前哨淋巴结(SLN)的定位标记成像，如非小细胞肺癌、食道癌等癌症和胸膜部位疾病等。在鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下注射近红外荧光量子点作为肿瘤细胞淋巴示踪，通过近红外荧光成像系统观察到量子点被引流到前哨淋巴结。该方法是确定癌症是否扩散到身体其他部分的第一步，也是最关键的一步。近红外荧光量子点成像系统可同时显现外科手术区域和淋巴液排泄途径及节点，提供实时可视化成像来指导定位和外科切除术，因此克服了许多现有技术的局限性。

量子点在识别肿瘤细胞中的研究较多，但用在肿瘤治疗中鲜有报道。量子点的光学特性使其可以作为光敏剂用于光动力治疗中。Bakalova等在2004年报道，用量子点可以简单识别癌细胞与正常细胞，也可以单独将癌细胞杀死而不影响正常细胞。他们将量子点与特异性识别癌细胞的糖结合蛋白(又叫植物凝集素)抗体进行融合，将这种复合物加到癌细胞中，紫外线照射时，癌细胞与这种量子点结合发出绿色的荧光，正常细胞则不能结合亦不能显色，以此可用来区别正常细胞与癌细胞，而且经过持续的紫外线照射，可将癌细胞杀死。数据显示:紫外线照射60 min后，有10%～15%的癌细胞死亡，这仅是量子点在肿瘤治疗方面应用的尝试，相信不久的将来在这方面的研究会越来越多。

总之，与传统的有机染料相比，量子点具有的各种独特性质已得到充分的展现和利用，量子点作为荧光标记成像的一种有力工具，值得大力开展并完善这一工作。

6．1．3　动物活体成像

动物活体中量子点作为光学对比剂结合荧光成像系统可进行肿瘤的定位，实时监测肿瘤细胞的生长和转移，对肿瘤动力学的研究及指导癌症手术提供了帮助。聂书明等首次实现了用量子点同时在活体内定位和成像。他们用ABC triblock聚合物纳米颗粒层和聚乙二醇包被量子点，将其附着在单克隆抗体上，此抗体连接物可以和前列腺肿瘤细胞上的前列腺特异性抗原结合。这种量子点注射入有前列腺肿瘤的裸鼠循环系统后聚集到肿瘤细胞周围，荧光成像检测可得到在体肿瘤细胞敏感的多色的荧光图，获得肿瘤大小和定位的信息。他们还用未结合抗体的量子点去“被动”地定位肿瘤，发现尽管量子点可以从肿瘤血管上“渗漏”出来并在肿瘤上聚集，但这个过程比结合了抗体的量子点聚集要慢很多，效果也差。这种特别设计的量子点在较宽范围的pH值和盐条件下是稳定的，适用于复杂的体内实验。

Hoshion等利用量子点通过内吞作用进入小鼠的淋巴瘤细胞。结果显示:量子点标记物在细胞中很稳定，不会影响细胞的活动和功能;被量子点标记的淋巴瘤细胞经尾静脉注入小鼠体内，5天后用荧光显微镜和流式细胞仪结合组织切片观察，量子点标记物在外周血中的浓度约为10%。7天后在鼠的肝、肾、脾、肺中仍可观察到约20%的标记细胞。Byron等将一组4种表面各有不同修饰层的量子点注射入鼠体内，经循环实验发现，表面不同修饰的量子点在体内的半衰期也不同。利用表面材料，可确定量子点在体内的位置;实验结果表明，在体内4个月后，这些量子点仍能发出荧光。

在生物实验中，荧光染料的生物毒性也是关注的焦点之一。动物活体实验数据表明，在量子点标记的细胞及动物体内并未出现异常迹象，由此可以说明量子点荧光标记是一项安全有效的技术，至少在动物活体内如此。量子点作为荧光标记物在长时程追踪活体内的靶细胞时，是非常有用的生物成像工具。动物实验的数据也为量子点进一步在临床的应用积累了经验，研发适合人体组织的光学影像探测系统的量子点，将是今后重要的发展方向之一。

6．1．4　激素及生物因子研究成像

量子点不仅可以在细胞水平及动物活体中应用，在细胞亚结构中，甚至在激素和生物因子水平也有报道。在原位杂交培植和免疫组化中用量子点结合激光共聚焦扫描显微镜，可观察到三维空间中蛋白质和mRNA的关系。这种方法可显现蛋白质和相关联的mRNA合成和定位的功能性成像。Matsun利用量子点的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素和泌乳刺激素及它们的mRNA进行了三维成像。

量子点在各种生物因子中研究最多是表皮生长因子。Lidke等将量子点标记到表皮生长因子上，通过激光共聚焦显微镜，观测到肿瘤细胞通过胞吞途径特异性摄取这种表皮生长因子的全过程。量子点通过标记并结合荧光检测系统用于研究激素及生物因子，对生长发育学和内分泌学的研究打开了一个新窗口，提供了一种新的方法。

综上所述，量子点作为新兴的荧光成像材料，与先进的光学成像技术相结合，为实时动态监测细胞内和生物活体内的分子事件。提供了强有力的实验手段，为揭示生命活动规律及研究疾病的发生、诊断、治疗提供了新技术新方法，极大地促进了生命科学的发展。随着荧光标记研究领域的日益深入，如何提高量子点的生物相容性及对标记物的敏感性、特异性、稳定性及荧光的高效性等多方面的研究，将是下一步的重点。另外，如何更高效地将量子点与识别分子相结合也是一个有待解决的问题之一。然而，尽管在应用中存在着这些难点，量子点作为一种新的荧光标记物仍将为荧光成像带来新的高峰，对细胞生物学、光子学成像及医学领域也将会产生深远的影响。

6．2　量子点在荧光传感中的应用

自1998年，美国加州伯克利大学Alivisatos小组和印第安纳大学Nie小组同时在Science上发表了荧光量子点(QDs)可以作为生物探针标记细胞的创新性论文，初步解决了QDs的水溶性以及生物相容性问题，QDs在生物分析方面的应用迅速引起国内外学术界的高度重视。从此，围绕QDs的新型荧光探针的研究蓬勃发展起来。特别近几年来，QDs荧光探针作为新兴的分析工具备受瞩目，显示了巨大的应用价值和开发潜力。

QDs在荧光传感中的研究应用主要利用了QDs两方面的性质。一方面是QDs的表面结构对荧光的影响非常大。由于QDs比表面积大，表面相对原子数多，导致了表面原子的配位不足、不饱和键和悬空键增多，从而形成许多表面缺陷。表面缺陷又导致陷阱电子或空穴，它们反过来影响QDs的发光性质。因此一些物质与QDs发生物理、化学作用会引起QDs表面的电荷和组成改变甚至会引起核心电子空穴的重组，导致QDs荧光强度变化。基于QDs此性质的传感检测已有报道，大多针对一些金属离子和非金属离子，此类荧光探针的选择性与探针本身的关系不大，而与QDs表面修饰的配体有关。

另一方面由于QDs具有可调的发射波长可以满足任何供体的需求，其宽的激发光谱便于选择不直接激发受体的激发光谱，因此QDs是荧光共振能量转移(FRET)应用非常有前景的供体。当用荧光QDs作为FRET供体时，受体可以是有机荧光染料、金纳米粒子或其他荧光QDs等，而且QDs能够同时与几个受体作用，从而可以增强FRET信号、提高检测的灵敏度，预示着使用单一QDs作供体同时检测几种物质将成为可能。不仅如此，QDs还可作为共振能量转移的受体。目前，荧光QDs用于生物化学传感的报道主要依靠FRET，其研究应用主要涉及pH值、糖类以及各种酶的活性等的传感。

6．2．1　金属离子的检测

最初，A．Henglein等发现Cd2+、Zn2+、Mn2+都会对CdS或ZnS QDs产生相似的活化效应，导致荧光量子产率明显提高，由此推测表面状态的改变将直接影响QDs的荧光性质。A．V．Isarov发现加入Cu2+离子会导致CdS QDs的荧光猝灭，推测猝灭机制为:加入的Cu2+和QDs表面结合，Cu2+快速还原成Cu+，而一价Cu+离子会引起QDs内导带激发态电子与价带空穴产生重组，导致QDs的荧光猝灭。这是第一次报道金属离子与QDs相互作用的机制，为进一步应用QDs传感检测各种离子奠定了基础。基于同样的原理，Z．Roxenzweig等人率先实现了对金属离子的测定。他们发现配体在QDs识别离子过程中起关键作用，如以12巯基甘油(thioglycerol)修饰的CdS QDs与Cu2+作用后发生荧光猝灭，而对其他离子无响应;同样L－半胱氨酸修饰的CdS QDs与Zn2+作用后荧光增强，因此可将不同配体修饰的CdS QDs分别用作Cu2+和Zn2+的检测。随后Leblanc等发现多肽(Gly－His－Leu－Leu－Cys)修饰的CdS QDs可选择性地被Ag+和Cu2+猝灭，而其他的金属离子则可导致QDs荧光不同程度的增强，由此可实现Ag+和Cu2+的检测。国内学者则分别用不同的QDs如CdS、CdTe、CdSe/CdS、CdSe/ZnS检测铜离子，都有较好的选择性，并得到了满意的结果，但对于荧光猝灭机制的观点不一。Wang等认为，由于纳米粒子具有较多的表面缺陷，如果在其外表面包覆带隙比其本身带隙大的材料，将有效地消除表面缺陷，使荧光增强;反之，则使荧光猝灭。加入Cu2+后，则形成带隙较CdS小的Cu (OH)2，导致QDs荧光猝灭。Wang等则认为，Cu2+离子能与羰基中的氧原子发生配位作用结合到QDs表面，直接从光激发的QDs的导带捕获电子，从而导致QDs电荷转移，引起荧光猝灭。Jackie等利用谷胱甘肽(GSH)修饰CdTe QDs作为探针高通量、高选择性检测了Pb2+，检测限为2×10－8mol/L。通过荧光光谱、电镜成像、动力学光散射等多角度证明了猝灭机制: Pb2+对谷胱甘肽修饰的CdTe的猝灭不同于Cu2+的猝灭，Pb2+与CdTe表面的Cd2+竞争性地与配体GSH结合，从而使QDs表面失去GSH的保护作用，引起QDs荧光猝灭。

此外，基于离子对QDs的荧光增强作用检测金属离子也有报道。Chen等发现在过量半胱氨酸(Cys)存在，Ag+能增强L－Cys修饰的CdS荧光，据此建立了一种高灵敏、高选择性地检测银离子的方法。推测荧光增强机理可能是Ag+与L－Cys的巯基在CdS QDs表面形成了CdS/Ag－SR复合物，从而增加了新的辐射中心。Li等采用修饰剂L－肉毒碱(L－carnitine)合成了CdSe/ZnS纳米QDs，并发现Cd2+能与QDs表面的L－肉毒碱发生作用，导致QDs的荧光增强，据此可应用于Cd2+的检测。但该方法的检出限只有5×10－5mol/L，因此选择合适的表面修饰剂以提高灵敏度是解决问题的关键。

为实现对金属离子的高灵敏选择性地测定，2007年H．A．Clark提出一种全新的思路，用高选择性聚合物作为离子识别部分。先在QDs表面包覆一层离子选择性的聚合物，又在聚合物外层包上生物相容性的分子。该离子选择性聚合物结构上包含一部分是对pH值有响应的分子，另一部分是选择性识别钠离子的分子。加入钠离子之前，聚合物为蓝色能吸收QDs的发射，猝灭QDs荧光;而加入钠离子后，会有H+释放出来，导致聚合物变为红色不能吸收QDs的荧光，QDs的荧光恢复。该方法大大提高了离子的选择性，而且该思路具有通用性，还可用于检测其他金属离子，是QDs选择性检测金属离子的新突破。

6．2．2　阴离子的检测

某些阴离子与QDs作用也使其荧光性质发生改变，因此QDs也用来检测部分阴离子。S．Alfredo用有机相合成了2－巯基氨基甲酸盐修饰的CdSe，经太阳光活化后，与CN－发生荧光猝灭，成功用于甲醇溶液中CN－的选择性测定。这是用QDs检测阴离子的首次报道。次年，他们又用水相合成2－巯基乙烷磺酸盐修饰的CdSe QDs，同样基于荧光猝灭实现了水溶液中CN－的测定，检测限达1．1×10－6mol/L，进一步提高了该方法的灵敏度，可以检测像氰化钾这样的剧毒物质。

M．Rivas等利用三辛基氧化磷(TOPO)修饰的QDs直接和二嘧啶、CuCl2溶液混合得到探针，利用二嘧啶和QDs疏水作用结合，同时又和Cu2+络合，引起Cu2+和QDs之间发生电子转移导致QDs荧光猝灭。当CN－存在时，CN－夺取Cu2+生成稳定的配合物，导致Cu2+和QDs之间的电子转移消失，QDs荧光恢复。这是第一次基于QDs荧光增强检测阴离子的报道。

6．2．3　pH值的检测

氢离子浓度在生物介质尤其是细胞生长、钙离子调节、酶活性、信号传导、离子传输、细胞内吞作用等过程中起重要作用。QDs对pH值传感主要利用对pH值有响应的染料分子作为识别部分和QDs连接，当pH变化时，染料分子随之发生变化，引起染料和QDs之间的共振能量转移效率变化，导致QDs荧光的变化。

2006年P．T．Snee以TOPO为配体有机相合成CdSe/ZnS，然后包覆聚丙烯酸，再通过1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化试剂与菁染料偶联，得到探针。pH值的变化会引起QDs与染料间的共振能量转移效率的变化，从而实现对pH值的比率传感，根据此原理构建了QDs比率传感器的通用方法。2007年他们又在原来基础上对该pH传感器做了进一步改进。用巯基功能化的聚合体包覆TOPO修饰的CdSe/ ZnS，再与染料氟硼荧(BOD IPY)马来酰亚胺或者与荧光素马来酰亚胺染料在水溶液中混合反应合成探针。同样基于共振能量转移原理，但该探针的合成不需另加活化剂，避免了偶联过程中造成的QDs的团聚沉淀，而且形成的硫醚键在生理条件下很稳定，能更好地检测生理条件下的pH值。

6．2．4　各种酶的活性检测(www.daowen.com)

酶是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，因此酶的检测一直是人们研究的热点。QDs对酶的传感检测大多数是基于荧光共振能量转移原理设计的。为保证探针的高选择性，一般选择酶或蛋白能特异性打断的小肽或DNA链作为识别部分，其一端连接QDs，另一端与有机染料或猝灭剂连接，此时两端距离比较近，发生共振能量转移，而当酶或蛋白存在时打断小肽或DNA链，QDs和染料或猝灭剂分开，FRET消失，荧光发生变化。

2006年Z．Rosenzweig小组第一次利用QDs荧光探针检测溶液中的胶原酶。利用TOPO修饰的CdSe/ZnS与一个标记了罗丹明的四肽进行配体交换，QDs与罗丹明之间发生FRET;遇到蛋白水解酶后，小肽被打断，共振能量转移消失，从而测得了胶原酶的活性。

同年I．Mendintzl等利用同样的FRET机制，设计出检测一系列水解酶活性的通用方法，而且FRET效率可以控制。他们利用一端带组氨酸(His)标签，另一端标记了染料或猝灭剂的特异性小肽，通过His和QDs配位自组装形成探针，QDs和染料或猝灭剂之间发生FRET，而加入酶后，小肽切断，FRET消失。基于此原理检测了一系列水解酶如凝血酶、胶原酶、糜蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase 3的活性。本实验不仅可以监测酶的活性，还可以获得酶的反应速率、Miichaelis－Menten动力学参数以及酶的抑制机制的相关信息。

2008年M．Suzuki等以染料或荧光蛋白为受体，QDs为供体，构建了多个基于FRET的生物传感器，检测了多种类型的酶，包括蛋白水解酶、DNA酶、DNA聚合酶。实验通过酶特异性打断或结合引起荧光的变化从而检测蛋白酶、DNA酶或DNA聚合酶的变化，更重要的是可实现单一激发波长下两种酶的检测，这是第一次利用QDs体系进行二元检测，为今后利用QDs同时检测多种物质和生理相关的各种现象打下了良好的基础。

J．H．Rao小组则基于生物共振能量转移原理实现了蛋白水解酶活性的检测，特异性小肽一端带6－His标签，另一端标记荧光素酶，CdSe/ZnS与小肽上的6－His标签和溶液中的Ni2+自组装连接合成探针。当荧光素酶的底物存在时，生物发光产生，并通过共振能量转移给QDs。当蛋白水解酶存在时打断小肽，生物共振能量转移消失。以往的实验中QDs都是作为能量供体，往往是一个QDs供体对应多个受体，可能会造成自猝灭或受体荧光发射过低，而在此QDs是作为能量受体避免了这一可能性。而且该探针所用的QDs不用进行特别修饰，操作更简单、方便。

相比共振能量转移而言，基于电子转移机制的QDs荧光传感有待进一步开发。2006 年R．Gill等通过EDC偶联试剂将CdSe/ZnS和酪氨酸(Tyr)偶联，形成QDs－Tyr复合物，在酪氨酸酶和氧气作用下，Tyr上的酚羟基变成苯醌发生电子转移猝灭QDs的荧光。利用该原理设计了检测凝血酶活性的探针，通过QDs与凝血酶特异性打断的小肽相连，该小肽末端是酪氨酸，当加入酪氨酸酶后，发生电子转移，QDs的荧光猝灭，猝灭效率较低仅为33%。加入凝血酶后，电子转移消失，致使荧光恢复，从而实现活性检测。该方法既能成功地监测生物催化转换，又可检测酪氨酸酶、凝血酶的活性。

6．2．5　糖类物质的检测

糖不仅是生命活动所需能量的来源和重要的中间代谢产物，而且是许多疾病诊断必不可少的指标。QDs对糖类物质的传感已有报道，主要利用QDs与识别糖的生物分子如糖结合蛋白、酶等组装，基于共振能量转移或者电子转移引起QDs的荧光变化来实现，大大提高了分析检测的灵敏度和选择性。

6．2．5．1　麦芽糖的检测

2003年H．Mattoussi等通过重组技术，使麦芽糖结合蛋白(MBP)的C－端带上5－His，与QDs配位，形成QDs－MBP，再与β－环糊精(β－CD)－QSY9猝灭剂通过非共价自组装，观察到由于QDs－QSY9之间的FRET，QDs的荧光被猝灭;而加入麦芽糖后，麦芽糖取代β2CD2QSY9，猝灭剂与QDs分离，共振能量转移消失，QDs的荧光恢复。此外，他们又在该基础上加以改进，花菁3 (Cy3)标记的MBP与QD配位，形成QD－MBPCy3，再将β－CD－花菁3．5 (Cy3．5)结合到MBP上，形成QD－MBP－Cy3－β－CDCy3．5，由于QDs、Cy3和Cy3．5之间发生了二步FRET，克服了QDs与受体之间距离的限制，QDs和Cy3的荧光猝灭;当加入MBP取代β－CD－Cy3．5后，Cy3的荧光恢复，便形成了两种麦芽糖传感器。这是第一次报道自组装QDs纳米生物传感器，该方法大大促进了新型复合材料传感器的发展。

6．2．5．2　葡萄糖的检测

葡萄糖是维持生命活动必不可少的物质，是许多疾病的诊断、治疗监控和疾病预防等必不可少的指标，因此对其准确检测具有重要意义。

2006年B．Singaram小组基于电子转移原理实现了葡萄糖的传感。利用CdSe/ZnS和硼酸取代的紫罗碱之间的静电作用结合，从而发生电子转移导致QDs荧光猝灭。加入葡萄糖时，因葡萄糖与紫罗碱上的硼酸结合能力更强，从而把QDs替换下来，电子转移消失，荧光恢复。该方法比较简单灵活，而且具有通用性，可以根据特定检测需要来选择QDs的组分和受体猝灭剂。

2008年I．Willner小组基于反应产物过氧化氢与CdSe/ZnS QDs表面作用引起的荧光猝灭，构建了葡萄糖传感的新方法。他们把GSH修饰的CdSe/ZnS通过辛二酸与标记了异硫氰酸荧光素(F ITC)的抗生物素蛋白结合，形成QDs－avidin－F ITC，再与标记了葡萄糖氧化酶(GOX)的生物素(biotin)通过自组装结合得到所需探针。葡萄糖在GOX催化下和氧气反应生成葡萄糖酸和H2O2，而H2O2猝灭QDs荧光，从而可以实现对葡萄糖的检测，而F ITC本身的荧光不受影响可以同时进行标记。该纳米生物复合传感器不仅具有生物催化功能，而且可进行荧光标记和荧光比率分析。

最近，Tang等利用CdTe QDs和纳米金(Au)之间的共振能量转移设计出高选择性和高灵敏度地检测血清中葡萄糖的纳米生物传感器。CdTe表面通过偶联试剂和伴刀豆蛋白(ConA)结合，形成CdTe－ConA，再与β－CD－Au自组装形CdTe－ConA－β－CDs－AuNPs，由于QDs与纳米金之间发生共振能量转移，QDs的荧光被猝灭。加入葡萄糖后，葡萄糖竞争结合ConA，把β－CD－Au替换下来，共振能量转移消失，QDs的荧光恢复，该纳米生物传感器，利用了纳米金良好的猝灭特性以及一个纳米金上可以连多个QDs，大大提高了共振能量转移的效率，提高了检测的灵敏度，不仅可以直接检测实际的生物样品，而且为单细胞内低水平葡萄糖的检测提供了可能性。

综上所述，量子点技术在光化学传感器中的应用，引起了科研工作者的高度重视，量子点光化学传感器的不断发展和完善必然会给分析化学领域带来新的发展契机，进一步有效地设计制备量子点的方法和进行功能化应用研究，将为量子点光化学传感器的发展开辟广阔的前景。

6．3　量子点在电化学传感中的应用

QDs除具有特殊的光学性质外，还具有独特的电化学及电致化学发光性质。量子点的电化学性质主要指QDs作为电子载体转移电子和作为光子受体吸收并转化光子的能力，光子的吸收将会导致产生与QDs表面很接近的电子－空穴对，很容易引起氧化还原反应，直接表现为电流响应灵敏度的高低。目前的研究主要集中在QDs自组装或掺杂膜的电化学性质和包裹配体分子的QDs的电化学性质的研究，这些研究成果极大地促进了基于QDs的电化学生物传感器的发展。

在QDs自组装或掺杂膜电化学性质的研究方面，Franzl等的研究表明，两种不同尺寸并带不同电荷的CdTe量子点通过静电自组装后，所形成的双层结构能够更大地减少内部层与层之间的距离，更有利于单向能量的转移，转移速率(50 ps－1)比以前使用Langmuir－Blodgett技术构建的双层QDs提高了2．4倍。在TiO2膜上通过控制QDs尺寸能够调节光电化学响应和光催化效率。在偏置电压下，CdSe在磷脂双层膜中能引发电流脉冲，电流的波动、起伏和变动均依赖于偏置电压的大小和膜中QDs的浓度。通过对纳米蚀刻技术合成的两种掺杂CdS或PbS量子点的溶胶/凝胶杂化有机/无机薄膜研究后，表明该薄膜具有良好的稳定性，可以用来在电极上固定生物大分子，制备电化学生物传感器。另外，QDs的电化学性质还依赖于温度、所用电解质材料、结合到电极上的方式和在上面排列的方式等。

在包裹配体分子的QDs的电化学性质方面，由于QDs拥有大的比表面积和覆盖有功能化的配体，使得QDs在光电激发下很容易与环境之间相互传递电荷。对巯基包裹的CdTe的电化学行为研究表明，在伏安图中出现了几个不同的氧化还原峰，这些峰的位置与CdTe的尺寸大小相关。该尺寸依赖性是由于量子尺寸效应引起的能带位置的改变所引起的，另外电荷也会对峰的位置产生一定的影响。当在QDs表面包裹了非电活性的表面配体(TOPO)与电活性配体(聚苯胺)后，配体和QDs的相互作用将导致QDs的电化学和光谱学性质发生改变。苯胺四聚体的配体交换极大地影响着量子点的最高已占轨道(HOMO)氧化和最低未占轨道(LUMO)还原的伏安曲线，使它们分别向着更高和更低的电势方向移动，这样就导致了配体催化的电势区域良好地分布于QDs之间，使得配体可以在没有改变QDs的氧化状态下通过电化学控制其在半导体态与导体态之间的转换。Sun等的研究表明，通过热分解控制配体分子在QDs表面的结合，可间接导致配体与QDs的相互作用改变，进而影响其电化学性质。另外，化学环境对QDs的稳定性及电子传导率也起到重要作用。

6．4．1　在电致化学发光传感中的应用

电致化学发光(ECL)是化学发光与电分析化学相结合的产物，是指通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生一些电生物质，这些电生物质之间或电生物质与体系中某些组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态而产生的一种发光现象，其主要优点是有效地避免了由激发光散射带来的背景干扰。该技术集成了发光分析的高灵敏度和电化学电势可控的优点，已成为分析化学工作者十分感兴趣的研究领域之一。QDs能在一定的电势下被氧化或还原，氧化态或还原态的QDs可以和溶液中存在的具有氧化或还原特性的物质之间发生电子转移而生成激发态的QDs，当QDs从激发态返回到基态时将会发射出光子，可作为ECL生物传感器的重要组件。将ECL技术和QDs结合起来，为QDs在分析科学与生命科学中的应用开辟了一条新途径。

自从2004年鞠熀先研究小组首次构建出第一支量子点ECL传感器并成功地用于H2O2的检测以来，基于QDs的ECL分析以其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析快速和容易实现自动化等优点，已成为电分析化学中一个十分活跃的研究热点，并与众多学科相交叉，研究和应用领域越来越广泛。ECL之所以能够用于分析物的测定，是因为ECL强度与ECL速率相关联，因而能影响发光强度和反应速率的因素都能够作为建立测定方法的依据。因此可以粗略地将基于QDs电致化学发光的生物传感器分为: ECL增强的电化学传感器、ECL猝灭的电化学传感器与增强反应速率的ECL电化学传感器。因为配体与QDs的相互作用能改善QDs的ECL性质，所以发展利用包裹配体以提高QDs的发光强度和提高灵敏度的电化学生物传感器得到了科研人员的广泛重视。Han等利用巯基包裹的QDs能增强ECL效应实现了H2O2的ECL检测，同时，也观察到ECL的红移现象，揭示了表面状态在该ECL过程中具有重要作用。

与ECL增强相比，ECL猝灭由于具有更大的响应范围，其应用也更为广泛。基于使用硫醇类化合物作为羟基自由基的清除剂时，会出现ECL猝灭效应，可构建检测羟基自由基清除剂的ECL猝灭传感器。基于ECL的能量从激发态的CdTe转移到邻苯二酚衍生物中，导致ECL猝灭，发展了一种检测多巴胺和L－肾上腺素的ECL猝灭传感器，该方法所检测物质的浓度范围较宽，分别从50 nmol/L～5 μmol/L和80 nmol/L～30 μmol/L，而常见的干扰物质如抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)都不会对检测造成干扰．。

QDs电致化学发光分析方法结合了化学发光和电化学分析的优点，可以从光学和电化学两个侧面对一些体系进行更全面的研究，这样更有利于揭示许多单一方法难以深入了解的问题;另一方面，QDs电致化学发光分析方法的灵敏度常取决于电极表面附近分析物的浓度，极大地方便了分离与富集，使其迅速发展成为最具竞争力的分析方法之一。

6．4．2　在电化学免疫分析中的应用

常用的免疫方法有酶联免疫吸附(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光技术。通常这些方法都比较费时，对健康有害，对人才素质和成本的要求较高。因此发展简单、快速、有效和容易操作的电化学免疫分析方法显得尤为重要。通过将电化学免疫分析的高选择性与纳米材料的高灵敏度结合在一起，为发展新型免疫分析传感器提供了一种新的途径。

在电化学生物传感器领域，由于QDs具有优秀的氧化还原性质、电催化活性、生物相容性和易制备的特性使得QDs可作为检测疾病相关蛋白质的标记物，通常标记有量子点的生物分子通过抗原－抗体或生物素－亲和素等特异相互作用组装到传感器界面后，通过量子点组成元素的溶出伏安响应，可定量检测相应物质的浓度。因为大量的金属离子(如Cd2+)将从一个单独的QDs里释放出来，所以使用QDs能有效地增强响应和提高检测限。QDs电化学免疫分析分为直接免疫分析、竞争位点分析和夹心免疫分析。

直接免疫分析主要用于检测抗体，该方法先将抗原固定在磁性微球上，再加入经QDs标记的抗体，经磁分离后，用溶出伏安分析法分析其中的金属离子浓度，从而达到检测目的。Liu等描述了一种在玻碳电极(GCE)上使用不同QDs (ZnS、CdS、PbS和CuS)同时检测多种蛋白质(β2－globulin，IgG，bovine serum albumin，C－reactive protein)的电化学免疫传感器，使用磁分离技术可有效地减少非特异性吸附，通过电化学溶出伏安法检测溶出的Zn2+、Cd2+、Pb2+和Cu2+，峰的位置和面积对应于各自抗原及其浓度水平，该传感器达到了fmol(10－15)的检测限，极低地检测限使得该方法在临床诊断中具有重要意义。

竞争免疫分析是指在基质中的未标记抗原与结合了QDs的抗原之间竞争抗体上的结合位点，最后通过测定与抗原相连接的QDs的信号来计算目标抗原被抗体俘获的数量。Du等构建了一种基于CdTe量子点增强信号输出的电化学生物传感器，实现了生物素对QDs修饰的中性抗生物素(neutravidin)的特异性识别和定量检测。该生物传感器在金电极表面自组装一层半胱氨酸膜，膜上连有作为识别元件的生物素，通过生物素与携带QDs的neutravidin特异性相互作用结合后，在1 mol/L HCl溶液中释放Cd2+，最后采用阳极溶出伏安分析法定量检测neutravidin的浓度。与早期的两步“夹心”法相比，此传感器只使用了一步竞争法，并且更准确、灵敏，对于快速、简便、低成本分析具有潜在的应用价值。

夹心免疫法使用第一抗体去捕获基质中的目标分析物，然后利用连接有QDs的第二抗体将目标分析物夹在两个抗体之间，然后通过QDs释放的Cd2+浓度去量化被捕获的分析物的浓度，QDs也可作为载体大量用于电化学催化标记，达到增强分析灵敏度的效果。Ding等利用DNA修饰的金纳米粒子(GNPs)，研发了一种电化学生物条形码免疫分析方法，该方法不需要酶就能定量检测α－胎蛋白(AFP)。该传感器通过将抗原夹在磁球(使用磁球可以简化分离步骤)修饰的抗体和连接有DNA和CdS的GNPs修饰的第二抗体之间，通过电化学溶出伏安分析Cd2+的浓度可以定量地分析抗原的浓度，研发了一种电化学生物条形码免疫分析方法，该方法不需要酶就能定量检测α－胎蛋白(AFP)。

结合免疫层析条技术的快速、低成本优点与纳米粒子电化学免疫分析技术的高灵敏度的优点，Liu等研发了一种一次性电化学免疫传感器，该传感器利用CdS和ZnS量子点作为标记物以增强信号的输出。夹心免疫反应在免疫层析条带上进行，被俘获的QDs标记物包埋在检测区域中的一次性丝网印刷电极上，经过7 min免疫反应后，其检测限估计为30 pg/mL，在20 min免疫反应后，检测限可以提高到10 pg/mL。可见，免疫反应时间在一定范围内对检测限的提高具有重要作用。该传感器已成功地应用于检测人血清样本中前列腺特异性抗原(PSA)，检测限为20 pg/mL，与商业化的PSA酶联免疫分析具有很高的一致性。这种新型的一次性电化学免疫传感器为临床诊断提供了一种快速、准确定量分析疾病相关标志蛋白的工具。

6．4．3　在电化学DNA传感中的应用

DNA杂交分析技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异性DNA序列片段的工具，所以高灵敏的检测DNA对于医学和生命科学的研究显得极为关键。电化学DNA生物传感器由于结合了电化学检测技术与DNA杂交分析的优点，克服了以往DNA杂交分析的许多缺点，成为近年来的一个研究热点，已逐渐应用于基因分析、染色体的基因定位及各种遗传病、传染病的早期诊断。许多电化学DNA生物传感器使用酶、电活性物质、纳米粒子来增强信号的输出以提高检测的灵敏度，其中QDs的电化学信号增强输出具有低成本、操作方法简单和灵敏度高的特点。Wang等提出了一种与直接免疫法相类似的同时检测多种DNA的电化学方法。他们在磁性微球表面上固定不同的DNA片段，与较长链的DNA探针进行互补杂交后，再用标记了CdS、ZnS和PbS量子点的目标DNA与之进行杂交，之后将捕获的QDs溶解得到金属子，用溶出伏安法测定相应的金属离子，即可同时测定目标DNA的浓度。Dong等利用层层自组装技术将聚电解质和CdTe量子点修饰到聚(苯乙烯－co－丙烯酸)微球上构建了检测DNA杂交的电化学DNA传感器，通过链霉素与生物素的特异性相互作用使QDs标记的微球连接上特异性识别乳腺癌DNA的DNA探针，使用方波伏安法检测溶解于HNO3中的Cd2+的浓度来达到检测DNA的目的。通过QDs和电化学DNA传感器由于其设备简单、灵敏度高、可控性强和选择性好等优点已成为生物电分析化学中的一个非常有生命力的前沿领域。建立新型电化学DNA分析方法、研制新型电化学DNA分析传感器以及扩展电化学DNA分析在临床医学分析和环境检测中的应用，无疑将是该领域的主要发展方向。另外，还可构建基于RNA杂交的电化学分析方法以扩展QDs在核酸分析中的应用。

6．4．4　在电化学蛋白质传感器中的应用

酶或氧化还原蛋白由于相对分子质量较大，导致传统的分析方法具有一定的局限性，电化学分析方法由于兼具有电化学分析的高灵敏度和酶的高选择性，使其在蛋白质分析领域具有重要地位。将酶或氧化还原蛋白与QDs连接构建的电化学生物传感器，在提高传感器的灵敏度方面已取得重大进展，这些生物传感器可用于分析生物学活性及电子转移机制。Hansen等利用核酸适配体与QDs结合第一次构建了一种能同时检测多种靶蛋白且具有很高灵敏度和选择性的电化学生物传感器。研究人员使用巯基适配体的混合单分子膜附着在金片上去捕获已连接上QDs的溶菌酶或凝血酶。当添加无QDs附着的溶菌酶或凝血酶时，它们可以竞争取代QDs标记的蛋白质，然后再利用电化学溶出伏安法检测保留在金基片上的Cd2+和Pb2+，能够达到亚皮摩尔(subpicomolar)水平的检测限，该方法将检测限提高了3～4个数量级，这种基于核酸适配体－蛋白质相互作用的分析方法可在疾病的早期在超低水平下检测相关疾病的标志蛋白，具有很重要的临床分析价值。细胞色素C是最重要的、研究得最为广泛的电子转移蛋白质之一，具有血红素活性中心，因此，细胞色素C可用来研究氧化还原酶对底物的催化机制。Stoll等使用二巯基化合物将CdSe/ZnS量子点固定于金电极上，构建了一种对超氧化物自由基非常灵敏的光电化学传感器。在光照条件下，光电流的产生条件依赖于外加的电压、光束的波长和测量的稳定性。通过电化学阻抗检测证明了由于QDs光激发电子－空穴对的产生提高了QDs层的电导率，QDs用不同的表面修饰剂(巯基丙酸、巯基琥珀酸和巯基吡啶)进行修饰后观察到了细胞色素C的直接电子转移。结果显示，该传感器能检测到高于纳摩尔(nanomolar)水平的超氧化物自由基。

氧化还原蛋白的电化学研究同样具有重要的理论价值和广阔的应用前景，尤其是血红蛋白(Hb)。Xu等研发了一种基于CdS量子点修饰Hb的电化学生物传感器，能用于H2O2的直接电化学检测。在普通石墨电极上，QDs修饰Hb的直接电子转移得以实现，结果显示响应电流依赖于扫描速度，表明该直接电化学过程是表面控制的电极过程。UV－vis光谱的研究结果表明，Hb与QDs结合后的构象不同于Hb单独存在时的构象，并且该构象能够随着pH值从3．0～10．0进行可逆的改变。处于QDs膜中的Hb能够保持其生物活性，并且此修饰电极具有过氧化物酶一样的催化能力，可用作H2O2检测的生物传感器。

经过这些年的发展，QDs电化学生物传感器已成为生物电分析化学的前沿领域，QDs的引入为电化学生物传感器的发展注入了新的元素，极大地推动了电化学生物传感器的发展。虽然这些QDs电化学生物传感器具有很高的灵敏度和选择性，但它们在临床样品检测中，仍然需要经过严格的测试和控制来评估其与传统分析方法在重现性、稳定性和成本方面的优势，并且还需进一步增强信号的输出和降低噪声，以提高信噪比。因为配体和QDs的相互作用将强烈影响QDs的性质，所以寻找生物相容性好，并且能极大提高QDs发光效率的配体也是该领域的一个研究热点。此外，QDs在与生物分子发生电子与空穴传输过程中将导致其光谱发生变化，并且对生物分子产生重大影响，这些对于电化学传感器的灵敏度和准确度的研究很重要，但目前这方面的研究还比较少。利用各种前沿交叉技术来研制集成化、微型化、实用性强的电化学传感器，扩大电化学传感器在化学分析、在临床医学分析和环境检测中的应用范围，将是未来电化学生物传感器的主要发展方向。