第3章　纳米材料测试方法及技术

纳米材料的特殊性质与其微观结构有着密切的关系，搞清纳米材料的微观结构对了解纳米材料的特性及其应用十分重要。因此，纳米材料的结构和性能表征是纳米科技最重要的研究课题之一。实验研究主要运用各种分析手段来观察和探测材料的微观结构及其变化，探讨结构与性质的关系。运用的仪器和方法主要有透射电子显微镜、小角中子散射、X射线衍射、Mossbauer谱学、扩展X射线吸收谱精细结构、正电子湮没、高分辨率电镜、原子力显微镜、扫描力显微镜、扫描隧道显微镜和扫描探针显微镜等。在众多的表征手段中，谱学方法独树一帜，通过各种谱学技术，不仅可以探知其微观结构的信息，还可以了解纳米材料的许多性质，特别是光学方面的性质。

3．1　红外光谱法

一定频率的红外光辐照能导致被照射物质分子在振动、转动能级上的跃迁。当分子中某些化学键或基团(具有偶极特性)的振动频率与红外辐射的频率一致时，分子便吸收此红外辐射(一种共振吸收)。若以频率连续改变的红外光辐照试样，由于试样对不同频率的红外光的吸收不同，便得到以吸光度A或透光率T为纵坐标，红外辐射波数或波长为横坐标的红外光谱图。

红外光谱可分为近红外(175～215 μm)、中红外(215～25 μm)和远红外(25～1 000 μm)三个区，但研究最多的是中红外光谱。红外光谱主要研究在振动中伴随有偶极矩变化的化合物，只有这种振动才具有红外活性。红外光谱仪常用硅碳棒等在高温下作为红外光源。它所发生的红外光透过样品池(常用NaCl晶片做成)进入光学单色器和检测器，最后用记录器记录下红外光谱。通过红外光谱的测定，不仅可以提供材料表面的结构信息，确定最佳实验条件，考察材料的红外特性，还可以作为一种估测材料晶化程度和粒径大小的表征手段。目前，最常用的是傅里叶变换红外光谱(FTIRS)，主要集中研究纳米氧化物、氮化物和纳米半导体等材料。在纳米材料研究中，红外光谱可提供纳米材料中的空位、间隙原子、位错、晶界和相界等方面的信息。在纳米粉末制备过程中，可以用FTIRS来表征结构的变化。FTIRS还常用来研究纳米材料与一般材料表面性质的差别。利用有机小分子本身能给出较强的红外信号，又对所处的环境十分敏感的特点，通过它们在纳米材料和一般固体材料上吸附时，红外吸收频率和强度变化来探测它们表面性质的差异。通常认为晶体的形状并不会对它的化学性质有很大的影响，但是当晶体尺寸在1～10 nm时，形状会有显著影响。从目前的研究来看，这是一种纳米尺度效应，主要取决于纳米膜的组成、结构和厚度。有关异常红外效应的研究涉及材料、光谱学、表面化学和物理等多个领域，已成为当前热点之一。

3．2　X射线衍射法

3．2．1　X射线衍射基本原理

特征X射线及其衍射X射线是一种波长很短(为20～0．06 nm)的电磁波，能穿透一定厚度的物质，并能使荧光物质发光、照相乳胶感光、气体电离。在用电子束轰击金属“靶”产生的X射线中，包含与靶中各种元素对应的具有特定波长的X射线，称为特征(或标志) X射线。考虑到X射线的波长和晶体内部原子间的距离(10－8cm)相近，1912年德国物理学家劳厄(M．von Laue)提出一个重要的科学预见:晶体可以作为X射线的空间衍射光栅，即当一束X射线通过晶体时将会发生衍射;衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上增强，而在其他方向上减弱;分析在照相底片上获得的衍射花样，便可确定晶体结构。这一预见随后被实验所验证。1913年英国物理学家布拉格父子(W．H．Bragg，W．L．Bragg)在劳厄发现的基础上，不仅成功地测定了NaCl、KCl等的晶体结构，并提出了作为晶体衍射基础的著名公式——布拉格定律: 2d sin θ= nλ，式中，λ为入射线的波长;θ是衍射角; d是结晶面间隔;衍射的级数n为任何正整数。当X射线以掠角θ(入射角的余角，又称为布拉格角)入射到某一具有d点阵平面间距的原子面上时，在满足布拉格方程时，会在反射方向上获得一组因叠加而加强的衍射线。

X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。将具有一定波长的X射线照射到结晶性物质上时，X射线因在结晶内遇到规则排列的原子或离子而发生散射，散射的X射线在某些方向上相位得到加强，从而显示与结晶结构相对应的特有的衍射现象。衍射X射线满足布拉格方程: 2d sin θ= nλ，波长λ可用已知的X射线衍射角测定，进而求得面间隔，即结晶内原子或离子的规则排列状态。将求出的衍射X射线强度和面间隔与已知的表对照即可确定试样结晶的物质结构，即定性分析。从衍射X射线强度的比较，可进行定量分析。本法的特点在于可以获得元素存在的化合物状态、原子间相互结合的方式，从而可进行价态分析，可用于对环境固体污染物的物相鉴定，如大气颗粒物中的风沙和土壤成分、工业排放的金属及其化合物(粉尘)、汽车排气中卤化铅的组成、水体沉积物或悬浮物中金属存在的状态等。

3．2．2　X射线分析的新发展

金属X射线分析由于设备和技术的普及已逐步成为金属研究和材料测试的常规方法。早期多用照相法，这种方法用时较长，强度测量的精确度低。20世纪50年代初问世的计数器衍射仪法具有快速、强度测量准确，并可配备计算机控制等优点，已经得到广泛的应用。但使用单色器的照相法在微量样品和探索未知新相的分析中仍有自己的特色。从20世纪70年代以来，随着高强度X射线源(包括超高强度的旋转阳极X射线发生器、电子同步加速辐射、高压脉冲X射线源)和高灵敏度探测器的出现以及电子计算机分析的应用，使金属X射线学获得新的推动力。这些新技术的结合，不仅大大加快分析速度，提高精度，而且可以进行瞬时的动态观察以及对更为微弱或精细效应的研究。

近年来发展起来的小角X射线散射(small angle X－ray scattering，SAXS)是分析纳米材料结构的理想工具，纳米材料由于颗粒细小，极易形成团粒，通常采用的粒度分析仪将会给出错误的数据。采用X射线小角散射法可以克服团粒造成的困难，准确给出纳米材料的颗粒尺寸。为了获得一束平行度极佳的准真X光束，一般采用狭缝控制。如果X光束准真性略差，则会增加原光束附近的本底，从而掩盖了小角散射的信息，因此要求狭缝很细小。SAXS适用于液体和固体等不同种类的样品分析。对尺度在1～100 nm的超分子结构内部排列方式的准确理解有助于解释材料的宏观性质进而实现可控制备。X射线小角散射(SAXS)是发生于原光束附近零至几度范围内的相干散射现象，物质内部尺度在1 nm至数百纳米范围内的电子密度的起伏是产生这种散射效应的原因。利用SAXS技术可以表征物质的长周期、准周期结构和测定纳米粉末的粒度分布，广泛应用于纳米尺度的各种金属、无机非金属、有机聚合物粉末以及生物大分子、胶体溶液、磁性液体等颗粒尺寸分布的测定;也可对各种材料中的纳米级孔洞、偏聚区、析出相等的尺寸进行分析研究。其粒度分析结果在统计上有充分的代表性，其制样方法相对比较简单，对颗粒分散的要求也不像其他方法那样严格。

3．2．3　X射线衍射分析在纳米材料研究中的应用

纳米材料自问世以来，受到科学界追捧，成为现今材料科学中最为活跃的研究领域。纳米材料根据不同尺寸和性质，在电子行业、生物医药、环保、光学等领域都有着巨大开发的潜能。在将纳米材料应用到各行各业的同时，纳米材料本身的制备方法和性质的研究也是目前国际上非常重视和争相探索的方向。

纳米材料广义上是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围超精细颗粒材料的总称。根据2011年10月18日欧盟委员会通过的定义，纳米材料是一种由基本颗粒组成的粉状或团块状天然或人工材料，这一基本颗粒的一个或多个三维尺寸在1～100 nm之间，并且这一基本颗粒的总数量在整个材料的所有颗粒总数中占50%以上。

纳米材料的化学组成及其结构是决定其性能和应用的关键因素，而要探讨纳米材料的结构与性能之间的关系，就必须对其在原子尺度和纳米尺度上进行表征，其重要的微观特征包括晶粒尺寸及其分布和形貌。

纳米材料的结构测定以X射线衍射为主。关于用XRD表征纳米材料的物相和粒径的报道很多。可以根据特征峰的位置鉴定样品的物相，根据峰面积还可确定其相含量。可用X射线衍射线半高宽法(谢乐公式)测定颗粒晶粒度。当颗粒为单晶时，该法测得的是颗粒度。当颗粒为多晶时，该法测定的是组成颗粒的单个晶粒的平均晶粒度，但这种方法只适用于晶态的纳米粉晶粒度的评估。实验表明，晶粒度≤50 nm时，测量值与实际值相近，反之，测量值往往小于实际值。依据X射线衍射图，还可用德拜—谢乐法计算晶体的晶格畸变。但是目前的多数实验室测试方法不够规范和统一，从而使得不同实验室对同一样品测定的数据有较大的误差。为此，2009年4月1日发布了纳米材料晶粒尺寸及微观效应的测定——X射线衍射线宽化法的国家标准。

3．3　光电子能谱法

电子能谱法是近30年里发展起来的一种多种技术集成的总称。这些彼此独立、但又相互依赖的各种技术组成并开辟了一个以测量电子能量分布来研究表面的新领域。它的基本原理是用单色光源(如X射线、紫外光)或具有一定能量的电子束等去照射样品，使原子或分子的内层电子或价电子受激而发射出来。这些被光子激发出来的电子称为光电子。测量光电子的能量，以电子动能为横坐标，相对强度(脉冲数/s)为纵坐标作出光电子能谱图，从而获得与试样有关的信息。用X射线作激发源的称为X射线光电子能谱;用紫外光作激发源的称为紫外光电子能谱;若样品用电子束(或X射线)激发，测量样品发射的Auger电子的能量分布，则称为Auger电子能谱。其中X射线光电子能谱法对化学分析最有用，被称为化学分析光电子能谱法(electron spectroscopy for chemical analysis，ESCA)。电子能谱法着重于研究光(或其他粒子)和物质相互作用后被激发出的电子的特性，而通常的光谱法是研究光和物质相互作用后光的特性。

用X射线照射固体时，由于光电效应，原子的某一能级的电子被击出物体之外，此电子称为光电子。如果X射线光子的能量为hν，电子在该能级上的结合能为Eb，射出固体后的动能为Ec，则它们之间的关系为: hν= Eb+ Ec+ Ws，式中Ws为功函数，它表示固体中的束缚电子除克服个别原子核对它的吸引外，还必须克服整个晶体对它的吸引才能逸出样品表面，即电子逸出表面所做的功。上式可另表示为: Eb= hν－Ec－Ws，可见，当入射X射线能量一定后，若测出功函数和电子的动能，即可求出电子的结合能。由于只有表面处的光电子才能从固体中逸出，因而测得的电子结合能必然反映了表面化学成分的情况。这正是光电子能谱仪的基本测试原理。

X射线光电子能谱(XPS)是较常用的表面分析技术之一，不仅能测定材料表面的组成元素，而且还能给出各元素的化学状态信息，在很多领域都有广泛用途。X射线光电子能谱(XPS)的优点是其样品处理的简单性和广泛的适应性与高信息量。XPS的最大特色在于能获取丰富的化学信息，对样品表面的损伤最轻微，表面的最基本XPS分析可提供表面存在的所有元素(除H和He外)的定性和定量信息。正是由于XPS含有化学信息，它也通常被称为化学分析电子能谱，XPS的更高级应用可得到关于表面的化学组成和形成的更详细的信息。

利用XPS可分析纳米材料的表面化学组成、原子价态、表面形貌、表面微细结构状态及表面能态分布等。对高分辨XPS谱的谱峰进一步的谱线分解拟合还可以确认新的基团或元素。由于原子在某一特定轨道的结合能依赖于原子周围的化学环境，因而从X射线光电子能谱图指纹特征可进行除H、He外的各种元素定性分析。从谱峰的位移和形状可获得化学价态、化学结构和物理状态;从谱峰相对强度比可获得不同元素及化学态半定量分析;从谱峰和背景强度变化可获知不同元素及化学态浓度分布及膜的厚度。根据电子结合能变化还可判断元素可能价态，从而确定元素的可能配位环境，提出配合物的可能构型。

3．4　纳米粒径测定法

纳米粒度仪是用物理的方法测试固体颗粒的大小和分布的一种仪器，其采用高速数字相关器和高性能光电倍增管作为核心器件，具有操作简便、测试快捷、高分辨、高重复及测试准确等特点，是纳米颗粒粒度测试的首选产品。

3．4．1　基本原理

采用动态光散射原理和光子相关光谱技术，根据颗粒在液体中的布朗运动的速度测定颗粒大小。小颗粒布朗运动速度快，大颗粒布朗运动速度慢，用激光照射这些颗粒，不同大小的颗粒将使散射光发生快慢不同的涨落起伏(图3．1)。光子相关光谱法就根据特定方向的光子涨落起伏分析其颗粒大小。

图3．1　纳米颗粒散射光强随时间变化曲线

对单个纳米颗粒进行观察并收集其不规则的波动的散射光强信号，扩散系数D同颗粒粒径x之间满足Stock－Einstein方程式:

式中　D——扩散系数;

KB——波尔兹曼常数;

η——溶剂的黏度;

T——绝对温度;

x——微粒的粒径。

通过上式，我们知道了扩散系数D和微粒粒径x之间的关系，因此可以得到自相关函数G(τ):

G(τ)=＜Is(θ，0) Is(θ，τ)＞=＜I＞2{ 1 + exp［－2D(x)q2τ］}

=＜I＞2{ 1 + exp(－2q2KBTτ/3πηx) }

从自相关函数我们得到光强衰减变化I(θ)同扩散系数D(x)的关系式，再从Stock－ Einstein方程式得到颗粒粒度大小同光强衰减变化I(θ)的关系，从而得到光强变化的衰减常数与粒径常数x成反比:

衰减常数∝1/x

纳米粒度仪颗粒尺寸的确定:

第一步，通过光强衰减变化计算自相关函数G(τ)。

第二步，从ln(G(τ)－1)函数的斜率求解粒径，如图3．2。

图3．2　颗粒粒径与光强衰减变化曲线

所以，光强衰减变化快，颗粒细;光强衰减变化慢，颗粒粗。

3．4．2　性能特点

(1)高灵敏度与信噪比　仪器的探测器采用专业级高性能光电倍增管，对光子信号具有极高的灵敏度和信噪比，从而保证了测试结果的准确度。

(2)极高的分辨能力　使用PCS技术测定纳米级颗粒大小，必须能够分辨纳秒级信号起伏。仪器的核心部件采用CR140数字相关器，具有识别8 ns的极高分辨能力和极高的信号处理速度，因此可以得到准确的测定结果。

(3)超强的运算功能　仪器采用高速数字相关器CR140进行数据采集与实时相关运算，其数据处理速度高，可实时有效地反映颗粒的动态光散射信息。

(4)稳定的光路系统　采用短波长LD泵浦激光光源和光纤技术搭建而成的光路系统，使光子相关谱探测系统不仅体积小，而且具有很强的抗干扰能力，从而保证了测试的稳定性。

纳米粒度仪适用于各种纳米级、亚微米级固体颗粒与乳液中微粒粒径的测定。

3．5　扫描电子显微镜技术

扫描电子显微镜(scanning electron microscope)，简称扫描电镜(SEM)。该仪器是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。它能产生样品表面的高分辨率的三维图像，能被用来鉴定样品的表面结构。

3．5．1　基本结构

3．5．1．1　真空系统

真空系统主要包括真空泵和真空柱两部分。

真空泵用来在真空柱内产生真空，有机械泵、油扩散泵以及涡轮分子泵三大类。机械泵加油扩散泵的组合可以满足配置钨枪的扫描电镜的真空要求，但对于装置了场致发射枪或六硼化镧枪的扫描电镜，则需要机械泵加涡轮分子泵的组合。真空柱是一个密封的柱形容器，真空柱底端的密封室，用于放置样品。

之所以要用真空，主要原因是电子束系统中的灯丝在普通大气中会迅速氧化而失效。因此，除了在使用扫描电镜时需要用真空以外，平时还需要以纯氮气或惰性气体充满整个真空柱。

3．5．1．2　电子束系统

电子束系统由电子枪和电磁透镜两部分组成，主要用于产生一束能量分布极窄的、电子能量确定的电子束用以扫描成像。

电子枪主要有两大类:一类是利用场致发射效应产生电子，称为场致发射电子枪。这种电子枪极其昂贵，在10万美元以上，且需要极高真空。但它具有至少1 000 h的寿命，且不需要电磁透镜系统。另一类则是利用热发射效应产生电子，有钨枪和六硼化镧枪两种。钨枪寿命在30～100 h，价格便宜，但成像不如其他两种明亮，常作为廉价或标准扫描电镜配置。六硼化镧枪寿命为200～1 000 h，价格约为钨枪的10倍，图像比钨枪明亮5～10倍，需要略高于钨枪的真空，一般在10～7 torr以上;但比钨枪容易产生过度饱和和热激发问题。

电磁透镜:热发射电子需要电磁透镜来成束，所以在用热发射电子枪的扫描电镜上，电磁透镜必不可少。通常会装配汇聚透镜和物镜，前者用于汇聚电子束，后者为真空柱中最下方的一个电磁透镜，它负责将电子束的焦点汇聚到样品表面。

3．5．1．3　成像系统

电子经过一系列电磁透镜成束后，打到样品上与样品相互作用，会产生次级电子、背散射电子、欧革电子以及X射线等一系列信号。所以需要不同的探测器，譬如次级电子探测器、X射线能谱分析仪等来区分这些信号以获得所需要的信息。有些探测器造价昂贵，比如Robinsons式背散射电子探测器，可以使用次级电子探测器代替，但需要设定一个偏压电场以筛除次级电子。

由于高能电子束与样品物质的交互作用，结果产生了各种信息:二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和透射电子等。这些信号被相应的接收器接收，经放大后送到显像管的栅极上，调制显像管的亮度。由于经过扫描线圈上的电流是与显像管相应的亮度一一对应的，也就是说，电子束打到样品上一点时，在显像管荧光屏上就出现一个亮点。扫描电镜就是这样采用逐点成像的方法，把样品表面不同的特征，按顺序、成比例地转换为视频信号，从而使我们在荧光屏上观察到样品表面的各种特征图像。

3．5．2　性能参数

3．5．2．1　放大倍数

扫描电镜的放大倍数M定义为:在显像管中电子束在荧光屏上最大扫描距离和在镜筒中电子束针在试样上最大扫描距离的比值。

M = l/L式中: l指荧光屏长度; L是指电子束在试样上扫过的长度。这个比值是通过调节扫描线圈上的电流来改变的。

3．5．2．2　景深

扫描电镜的景深比较大，成像富有立体感，所以它特别适用于粗糙样品表面的观察和分析。

3．5．2．3　分辨率

分辨率是扫描电镜的主要性能指标之一。在理想情况下，二次电子像分辨率等于电子束斑直径。

3．5．2．4　场深

在SEM中，位于焦平面上下的一小层区域内的样品点都可以得到良好的会焦而成像。这一小层的厚度称为场深，通常为几纳米厚，所以SEM可以用于纳米级样品的三维成像。

3．5．2．5　作用体积

电子束不仅仅与样品表层原子发生作用，它实际上与一定厚度范围内样品原子发生作用，所以存在一个作用“体积”。作用体积的厚度因信号的不同而不同:

(1)欧革电子　0．5～2 nm。

(2)次级电子　5λ，对于导体，λ=1 nm;对于绝缘体，λ=10 nm。

(3)背散射电子　10倍于次级电子。

(4)特征X射线　微米级。

(5) X射线连续谱　略大于特征X射线，也在微米级。

3．5．2．6　工作距离

工作距离指从物镜到样品最高点的垂直距离。如果增加工作距离，可以在其他条件不变的情况下获得更大的场深。如果减少工作距离，则可以在其他条件不变的情况下获得更高的分辨率。通常使用的工作距离在5～10 mm。

3．5．2．7　成像

次级电子和背散射电子可以用于成像，但后者不如前者，所以通常使用次级电子。

3．5．2．8　表面分析

欧革电子、特征X射线、背散射电子的产生过程均与样品原子性质有关，所以可以用于成分分析。但由于电子束只能穿透样品表面很浅的一层(参见作用体积)，所以只能用于表面分析。

表面分析以特征X射线分析最常用，所用到的探测器有两种:能谱分析仪与波谱分析仪。前者速度快，但精度不高，后者非常精确，可以检测到“痕迹元素”的存在，但耗时太长。(www.daowen.com)

3．5．3　主要应用

扫描电镜是一种多功能的仪器，具有很多优越的性能，是用途最为广泛的一种仪器。它可以进行如下基本分析。

3．5．3．1　观察纳米材料

纳米材料具有许多与晶体、非晶态不同的、独特的物理化学性质。纳米材料有着广阔的发展前景，将成为未来材料研究的重点方向。扫描电镜的一个重要特点就是具有很高的分辨率，现已广泛用于观察纳米材料。

3．5．3．2　材料断口的分析

扫描电镜的另一个重要特点是景深大，图像富立体感。扫描电镜的焦深比透射电子显微镜大10倍，比光学显微镜大几百倍。由于图像景深大，故所得扫描电子像富有立体感，具有三维形态，能够提供比其他显微镜多得多的信息，这个特点对使用者很有价值。扫描电镜所显示的断口形貌从深层次、高景深的角度呈现材料断裂的本质，在教学、科研和生产中，有不可替代的作用，在材料断裂原因的分析、事故原因的分析以及工艺合理性的判定等方面是一种的手段。

3．5．3．3　直接观察原始表面

它能够直接观察直径100 mm，高50 mm，或更大尺寸的试样，对试样的形状没有任何限制，粗糙表面也能观察，这便免除了制备样品的麻烦，而且能真实观察试样本身物质成分不同的衬度。

3．5．3．4　观察厚试样

其在观察厚试样时，能得到高的分辨率和最真实的形貌。扫描电子显微镜的分辨率介于光学显微镜和透射电子显微镜之间，但在对厚块试样的观察进行比较时，因为在透射电子显微镜中还要采用复膜方法，而复膜的分辨率通常只能达到10 nm，且观察的不是试样本身，因此用扫描电镜观察厚块试样更有利，更能得到真实的试样表面资料信息。

3．5．3．5　观察各个区域的细节

试样在样品室中可动的范围非常大，其他方式显微镜的工作距离通常只有2～3 cm，故实际上只许可试样在两度空间内运动，但在扫描电镜中则不同。由于工作距离大(可大于20 mm)，焦深大(比透射电子显微镜大10倍)，样品室的空间也大，因此可以让试样在三度空间内有6个自由度运动(即三度空间平移、三度空间旋转)，且可动范围大，这对观察不规则形状试样的各个区域带来极大的方便。

3．5．3．6　大视场低放大倍数的观察

用扫描电镜观察试样的视场大。在扫描电镜中，能同时观察试样的视场范围F由下式来确定:

F = L/M

式中: F为视场范围; M为观察时的放大倍数; L为显像管的荧光屏尺寸。若扫描电镜采用30 cm(12 in)的显像管，放大倍数15倍时，其视场范围可达20 mm。大视场、低倍数观察样品的形貌对有些领域是很必要的，如刑事侦查和考古。

3．5．3．7　从高到低倍数的连续观察

放大倍数的可变范围很宽，且不用经常对焦。扫描电镜的放大倍数范围(从5万～20万倍连续可调)很宽，且一次聚焦好后即可从高倍到低倍、从低倍到高倍连续观察，不用重新聚焦，这对进行事故分析特别方便。

3．5．3．8　观察生物样品

因电子照射而发生试样的损伤和污染程度很小。同其他方式的电子显微镜比较，因为观察时所用的电子探针电流小(一般为10－10～10－12A)，电子探针的束斑尺寸小(通常是5 nm到几十纳米)，电子探针的能量也比较小(加速电压可以小到2 kV)。而且不是固定一点照射试样，而是以光栅状扫描方式照射试样。因此，由于电子照射面发生试样的损伤和污染程度很小，这一点对观察一些生物试样特别重要。

3．5．3．9　进行动态观察

在扫描电镜中，成像的信息主要是电子信息，根据近代的电子工业技术水平，即使高速变化的电子信息，也能毫不困难地及时接收、处理和储存，故可进行一些动态过程的观察。如果在样品室内装有加热、冷却、弯曲、拉伸和离子刻蚀等附件，则可以通过电视装置，观察相变、断裂等动态的变化过程。

3．5．3．10　从形貌获得资料

在扫描电镜中，不仅可以利用入射电子和试样相互作用产生各种信息来成像，而且可以通过信号处理方法，获得多种图像的特殊显示方法，还可以从试样的表面形貌获得多方面资料。因为扫描电子像不是同时记录的，它是由近百万个逐次记录构成的，所以扫描电镜除了观察表面形貌外还能进行成分和元素的分析，以及通过电子通道花样进行结晶学分析，选区尺寸可以从10～3 μm。

由于扫描电镜具有上述特点和功能，所以越来越受到科研人员的重视，用途日益广泛。现在扫描电镜已广泛用于材料(金属材料、非金属材料、纳米材料)科学、冶金、生物学、医学、半导体材料与器件、地质勘探、病虫害的防治、灾害(火灾、失效分析)鉴定、刑事侦查、宝石鉴定、工业生产中的产品质量鉴定及生产工艺控制等。

3．5．4　样品处理

在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是:尽可能使样品的表面结构保存好，没有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。

3．5．4．1　样品的初步处理

(1)取材　对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8 mm×8 mm，厚度可达5 mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道黏膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

(2)样品的清洗　用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或黏液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察，因此在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。

(3)固定　固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。

(4)脱水　样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。

3．5．4．2　样品的干燥

扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种:

(1)空气干燥法　空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。

(2)临界点干燥法　临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般2～3 h即可完成，所以是最为常用的干燥方法。

(3)冷冻干燥法　冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤。

3．5．4．3　样品的导电处理

生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图像的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种:

(1)金属镀膜法　金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图像。

(2)组织导电法　用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属溶液对生物样品中的蛋白质、脂类和糖类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。

3．6　透射电子显微镜技术

透射电镜，即透射电子显微镜，是电子显微镜的一种。20世纪70年代，透射电子显微镜的分辨率约为0．3 nm(人眼的分辨本领约为0．1 mm)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2 000倍，所以通过电子显微镜能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。

3．6．1　透射电镜分类

3．6．1．1　大型透射电镜

大型透射电镜一般采用80～300 kV电子束加速电压，不同型号对应不同的电子束加速电压，其分辨率与电子束加速电压相关，可达0．2～0．1 nm，高端机型可实现原子级分辨。

3．6．1．2　低压透射电镜

低压小型透射电镜采用的电子束加速电压(5 kV)远低于大型透射电镜。较低的加速电压会增强电子束与样品的作用强度，从而使图像衬度、对比度提升，尤其适合高分子、生物等样品;同时，低压透射电镜对样品的损坏较小。

3．6．1．3　冷冻电镜

冷冻电镜(cryo－microscopy)通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度(77 K)，用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。

3．6．2　成像原理

透射电镜的成像原理是由照明部分提供的有一定孔径角和强度的电子束平行地投影到处于物镜平面处的样品上，通过样品和物镜的电子束在物镜后焦面上形成衍射振幅极大值，即第一幅衍射谱。这些衍射束在物镜的像平面上相互干涉形成第一幅反映试样为微区特征的电子图像。通过聚焦(调节物镜激磁电流)，使物镜的像平面与中间镜的物平面相一致，中间镜的像平面与投影镜的物平面相一致，投影镜的像平面与荧光屏相一致，这样在荧光屏上就观察到一幅经物镜、中间镜和投影镜放大后有一定衬度和放大倍数的电子图像。由于试样各微区的厚度、原子序数、晶体结构或晶体取向不同，通过试样和物镜的电子束强度产生差异，因而在荧光屏上显现出由暗亮差别所反映出的试样微区特征的显微电子图像。电子图像的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数的乘积。

3．6．3　像衬度

像衬度是图像上不同区域间明暗程度的差别。由于图像上不同区域间存在明暗程度的差别即衬度的存在，我们才能观察到各种具体的图像。只有了解像衬度的形成机制，才能对各种具体的图像给予正确解释，这是进行材料电子显微分析的前提。

3．6．3．1　非晶样品的像衬度

非晶样品透射电子显微图像衬度是由于样品不同微区间存在的原子序数或厚度的差异而形成的，即质量厚度衬度(质量厚度定义为试样下表面单位面积以上柱体中的质量)，也叫质厚衬度。质厚衬度适用于对复型膜试样电子图像作出解释。质量厚度数值较大的，对电子的吸收散射作用强，使散射到光栏以外的电子要多，对应较暗的衬度。质量厚度数值小的，对应较亮的衬度。

3．6．3．2　衍射衬度

对于晶体，若要研究其内部缺陷及界面，需把样品制成薄膜，这样，在晶体样品成像的小区域内，厚度与密度差不多，无质厚衬度。但晶体的衍射强度却与其内部缺陷和界面结构有关。由样品强度的差异形成的衬度叫衍射衬度，简称衍衬。

晶体试样在进行电镜观察时，由于各处晶体取向不同和(或)晶体结构不同，满足布拉格条件的程度不同，对应试样下表面处有不同的衍射效果，从而在下表面形成一个随位置而异的衍射振幅分布，这样形成的衬度，称为衍射衬度。这种衬度对晶体结构和取向十分敏感，当试样中某处含有晶体缺陷时，意味着该处相对于周围完整晶体发生了微小的取向变化，导致了缺陷处和周围完整晶体具有不同的衍射条件，将缺陷显示出来。可见，这种衬度对缺陷也是敏感的。基于这一点，衍衬技术被广泛应用于研究晶体缺陷。

衍衬成像，操作上是利用单一透射束通过物镜光阑成明场像，或利用单一衍射束通过物镜光阑成暗场像。近似考虑，忽略双束成像条件下电子在试样中的吸收，明暗场像衬度是互补的。明场像和暗场像均为振幅衬度，即它们反映的是试样下表面处透射束或衍射束的振幅大小分布，而振幅的平方可以作为强度的量度，由此便获得了一幅通过振幅变化而形成衬度变化的图像。

3．6．3．3　相位衬度

如果所用试样厚度小于100 nm，甚至30 nm，则它是让多束衍射光束穿过物镜光阑彼此相干成像，像的可分辨细节取决于入射波被试样散射引起的相位变化和物镜球差、散焦引起的附加相位差的选择。它追求的是试样小原子及其排列状态的直接显示。

薄晶成像是一束单色平行的电子波射入试样内，与试样内原子相互作用，发生振幅和相位变化。当其逸出试样下表面时，成为不同于原入射波的透射波和各级衍射波。由于试样很薄，衍射波振幅很小，基本上与入射波振幅相同，非弹性散射可忽略不计。衍射波与透射波间的相位差为π/2。如果物镜没有像差，且处于正焦状态，而光阑也足够大，使透射波与衍射波得以同时穿过光阑相干。相干结果产生的合成波其振幅与入射波相同，只是相位位置稍许不同。由于振幅没变，因而强度不变，所以没有衬度。要想产生衬度，必须引入一个附加相位，使所产生的衍射波与透射波处于相等的或相反的相位位置，也就是说，让衍射波沿图像X轴向右或向左移动π/2，这样，透射波与衍射波相干就会导致振幅增加或减少，从而使像强度发生变化，相位衬度得到了显示。

3．6．4　仪器结构

透射电子显微镜由以下几大部分组成:照明系统，成像光学系统，记录系统，真空系统，电气系统。

(1)照明系统　又称镜筒，是透射电镜的主体(详见图3．3)。照明系统主要由电子枪和聚光镜组成。电子枪是发射电子的照明光源。聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。

图3．3　基本的TEM光学元件布局图

(2)成像光学系统　主要由物镜、中间镜和投影镜组成。物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其他透镜进一步放大。物镜是一个强激磁短焦距的透镜，它的放大倍数较高，一般为100～300倍。目前，高质量的物镜其分辨率可达0．1 nm左右。中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在0～20倍范围调节。当M＞1时，用来进一步放大物镜的像;当M＜1时，用来缩小物镜的像。

在电镜操作过程中，主要利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。投影镜的作用是把经中间镜放大(或缩小)的像(电子衍射花样)进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强激磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角(约10－3rad)很小，因此它的景深和焦距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。有时，中间镜的像平面还会出现一定的位移，由于这个位移距离仍处于投影镜的景深范围之内，因此，在荧光屏上的图像仍旧是清晰的。

(3)观察和记录装置　包括荧光屏和照相机构，在荧光屏下面放置一个可以自动换片的照相暗盒。照相时只要把荧光屏竖起，电子束即可使照相底片曝光。由于透射电子显微镜的焦长很大，虽然荧光屏和底片之间有数十厘米的间距，仍能得到清晰的图像。

3．6．5　一般操作步骤

(1)抽真空　接通总电源，打开冷却水，接通抽真空开关，真空系统就自动地抽真空。一般经15～20 min后，高真空指示灯亮后即可上机工作。

(2)加电子枪高压　接通镜筒内的电源，给电子枪和透镜供电，由低至高速级给电子枪加高压，直至所需值。

(3)更换样品　通常在电子枪加高压而关断灯丝电源的条件下置换样品。取出样品时，首先打开过渡室和样品空间的空气锁紧阀门，向外拉样品杆，然后将过渡室放气，最终拉出样品杆，从样品座中取出样品。换上所需观察的样品，必须将样品钢网牢固地突持在样品杆的样品座中，然后将样品杆插入过渡室，抽过渡室低真空并使其达到真空度要求，打开过渡室和样品空间的空气锁紧阀，将样品杆推进样品室。

(4)加灯丝电流并使电子束对中　按顺时针方向转动灯丝电流钮，慢慢加大灯丝电流，注意电子束流表的指示和荧光屏亮度，当灯丝电流加大到一定值时，束流表的指示和荧光屏亮度不再增大，即达到灯丝电流饱和值。

(5)图像观察　当束流调到所需值后，最终推进样品杆，用样品平移传动装置把样品座调到观察位置，即可进行图像观察。首先在低倍镜下观察，选择感兴趣的视场，并将其移到荧屏中心，然后调节中间镜电流确定放大倍数，调节物镜电流使荧光屏上的图像聚焦至最清晰。

(6)照相记录　当荧光屏上的图像聚焦至最清晰时，便可进行照相记录。调节图像亮度和相应的曝光时间。当二者匹配得当(曝光表上绿灯亮)时，拉开曝光快门，将荧光屏翻起，让携带样品信息的电子束照射到胶片上使其感光，正常曝光时间以4～8 s为宜。

(7)停机　按顺序依次关断灯丝电源、高压、镜筒内的电源、抽真空开关，约30 min后关断总电源和冷却水。

3．6．6　试样的制备

(1)粉末样品的制备　用超声波分散器将需要观察的粉末在溶液中分散成悬浮液，用滴管滴几滴在覆盖有碳加强火棉胶支持膜的电镜铜网上。待其干燥后，再蒸上一层碳膜，即成为电镜观察用的粉末样品。

(2)薄膜样品的制备　块状材料是通过减薄的方法制备成对电子束透明的薄膜样品。制备薄膜一般按以下步骤:①切取厚度小于0．5 mm的薄块;②用金相砂纸研磨，把薄块减薄到0．1～0．05 mm的薄片，为避免严重发热或形成应力，可采用化学抛光法;③用电解抛光，或离子轰击法进行最终减薄，在孔洞边缘获得厚度小于500 nm的薄膜。

(3)复型样品的制备　样品通过表面复型技术获得。所谓复型技术，就是把样品表面的显微组织浮雕复制到一种很薄的膜上，然后把复制膜(叫作“复型”)放到透射电镜中去观察分析，这样才使透射电镜应用于显示材料的显微组织。复型方法中用得较普遍的是碳一级复型、塑料二级复型和淬取复型。

3．6．7　功能

早期的透射电子显微镜功能主要是观察样品形貌，后来发展到可以通过电子衍射原位分析样品的晶体结构。具有将形貌和晶体结构原位观察的两个功能，这是其他结构分析仪器(如光镜和X射线衍射仪)所不具备的。

透射电子显微镜增加附件后，其功能可以从原来的样品内部组织形貌观察(TEM)、原位的电子衍射分析(Diff)，发展到还可以进行原位的成分分析(能谱仪EDS、特征能量损失谱EELS)、表面形貌观察(二次电子像SED、背散射电子像BED)和扫描透射像(STEM)。

结合样品台设计成高温台、低温台和拉伸台，透射电子显微镜还可以在加热状态、低温冷却状态和拉伸状态下观察样品动态的组织结构、成分的变化，使得透射电子显微镜的功能进一步地拓宽。

透射电子显微镜功能的拓宽意味着一台仪器在不更换样品的情况下可以进行多种状态分析，尤其是可以针对同一微区位置进行形貌、晶体结构、成分(价态)的全面分析。