第四节　参与APP加工的分泌酶类

一、α分泌酶的分子组成和作用特点

α分泌酶不是单一的蛋白酶，而是一类膜结合蛋白。α分泌酶有下列特征:与APP共存于细胞，能分解细胞膜全长APP，水解APP分子内Aβ序列的Lysl6～Leul7部位。使其细胞表达增高能增加sAPPα分泌，反之其表达缺陷使sAPPα分泌减少。受相应APP经α分泌酶分解的组成性(constitutive)和调节性(regulated)因素调节。

有一类属于解聚素和金属蛋白酶(ADAM)家族成员的蛋白质(主要指ADAM10，ADAM17和ADAM 9)，被认为具有α分泌酶的生物学功能。该家族是具有多个结构域的跨膜蛋白质分子，其中金属蛋白酶结构域是α分泌酶发挥其活性的关键部位，抑制这一部位的药物如BB94、SB223820、BB3130等能显著抑制α分泌酶的生物学活性。一般认为，ADAM分子是以无活性的酶原形式存在，分别切除信号肽和前序列后，成为活性ADAM分子。

(一)ADAM10

ADAM10分子属于ADAM家族，原位杂交显示ADAM10和APP在小鼠和人的皮层神经元内存在共表达。ADAM10分子在Aβ序列的Lys16～Leu17间水解APP，其底物还包括对细胞生长发育至关重要的Notch分子。ADAM10分子在HEK293细胞的过表达使sAPPα基础分泌和蛋白激酶C(PKC)刺激后引起的sAPPα分泌增加数倍。因此ADAM10分子可能是参与sAPPα的组成性和调节性分泌的主要成分。维持ADAM10分子活性的条件:一是需要基因正确表达，如发生点突变(Glu384Ala)，其活性将受抑制;二是需要分子成熟，在PC7和furin分子作用下切除前序列后，活性才显著增加。

研究发现，AD患者的血小板和脑脊液内β分泌酶活性增高而ADAM10分子表达降低，且降低程度随疾病的进展加重。但ADAM10基因敲除后细胞还保持α分泌酶功能，说明ADAM10可能并非唯一的α分泌酶。

(二)ADAM17

ADAM17又称肿瘤坏死因子α转换酶(tumor necrosis factor-alpha convening enzyme，TACE)，也属于ADAM家族。其作用底物包括肿瘤坏死因子、APP等其他膜蛋白、L-选择素、转化生长因子和血管紧张素转换酶等。细胞ADAM17基因敲除后sAPPα的组成性分泌未受影响。但TACE的抑制剂对sAPPα的分泌同样有抑制作用。ADAM17主要参与sAPPα的调节性分泌。

在AD患者的皮层和海马，TACE与老年斑和神经原纤维缠结共存在，AD患者脑内未发现TACE表达的改变。在脑内ADAM17和APP只有部分共表达，因此研究认为ADAM17可能是α分泌酶的一种组分。

(三)ADAM9

ADAM9具有α分泌酶样的活性，但主要水解Aβ序列的Hisl4～Glnl部位。ADAM9和APP在COS细胞的共表达可使sAPPα的调节性分泌明显增高。细胞过表达ADAM9时，sAPPα的组成性分泌也增加。敲除ADAM9基因或用RNA干扰抑制ADAM9的活性，不显著影响α分泌酶的活性。

比较合理的解释是，尽管上述三者都具α分泌酶的部分功能，α分泌酶并非单一的任何上述ADAM分子，可能α分泌酶功能的完成是三者共同作用^［14］。

(四)其他相关成分

与α分泌酶密切相关还有另外两种物质。一种是前蛋白转换酶7(proprotein convertase 7，PC7)，另一种是BACE2。

PC7是一种丝氨酸蛋白酶，和furin一样都可以切除ADAM10酶原形式分子的前序列，转变为活性形式。但PC7为ADAM10分子成熟所必需。PC7可能和ADAM10一样，具有α分泌酶的功能。PC7对APP的作用可能是间接的。PC7可能在前α分泌酶的上游，即对ADAM分子酶原形式起作用。

BACE2和BACE1底物相同，包括野生型和突变型的APP。但BACE2裂解位点不同，主要在Aβ序列的19Phe～20Phe和20Phe～21Ala部位，破坏了完整Aβ分子形成有类似α分泌酶的作用。

sAPPα分泌方式主要有组成性分泌，即基础条件下的分泌;调节性分泌，指在蛋白激酶C激动剂如佛波醇酯或M受体激动剂的作用下，使sAPPα分泌显著增加。sAPPα的组成性分泌主要在细胞表面，而调节性分泌发生在细胞内，这与α分泌酶活性分子的分布基本一致。

APP可以经两条途径代谢，两个酶系统对同一底物APP进行竞争。如增强α分泌酶活性，对细胞具有营养作用的sAPPα生成增加，又减少了Aβ的产生。所以，增加α分泌酶的活性或表达，使APP的代谢趋向α分泌酶方向，可能是治疗AD一种有利的策略。

参与调节α分泌酶的活性和APP的代谢过程的多信号转导通路包括PKC、PKA、MAPK、胆碱能受体、Ca离子及PI3-K等通路。如PKC的激活能够提高α分泌酶的活性，但PKC的底物很可能是α分泌酶或者其他与囊泡运送有关的细胞分子。在模型动物中证实，某些激活PKC的物质可通过调节α分泌酶而有治疗AD的价值。现在认为，PKCα和PKCε对α分泌酶活性调节有较大的意义^［15］。PKC除直接激活α分泌酶之外，还介导M受体、谷氨酸受体以及缓激肽受体对α分泌酶的活性调节。

流行病学研究证实，服用某些药物使AD在服药人群中发生的危险性降低。研究证明药物能通过不同的途径最终使α分泌酶的活性发生改变。如雌激素可通过MAPK/PKC途径使sAPPα分泌增加，降胆固醇药物可在多种细胞系使sAPPα增加，使sAPPβ和Aβ减少，同时使α分泌酶ADAM10的活性增强。提示α分泌酶有可能作为AD治疗的新的药物靶点。

基因工程技术增加细胞ADAMs基因表达，可增加sAPPα的组成性和调节性分泌，减少Aβ生成。ADAM10基因转染模型动物也有类似结果。提示ADAM10对AD的潜在治疗作用。应在体外细胞和转基因动物中证实，用PKC激动剂，增加sAPPα分泌同样具有治疗作用。α分泌酶作为各种物质影响APP分解代谢调节的最后通路，有可能作为AD治疗的新的药物靶点。

二、β分泌酶

β分泌酶(β-secretase)又称β位淀粉样裂解酶-1(β-site amyloid cleavage enzyme 1，BACE1)。β分泌酶基因定位于11号染色体上(1lq2313)，在人体各组织广泛表达，胰腺和大脑神经元表达量最高。AD患者大脑有Aβ沉积的皮质表达比无Aβ沉积的小脑高3倍。

BACE是膜结合的天冬氨酸蛋白酶，BACE1有501个氨基酸组成，包含有N端信号肽、前蛋白区、膜外成熟蛋白区以及跨膜段和C端短的胞浆尾。N端外催化功能域的序列和构象与其他哺乳动物的天冬氨酸蛋白酶相似;中间有26个残基的跨膜区;羧基端是21个残基的胞质域。在催化区有两个活性位点，这两个位点构成了催化中心，其中D93和D289的两个天冬氨酸为保持活性所必需。与其他天冬氨酸蛋白酶一样，BACE具有一些N-糖基化位点和六个半胱氨酸残基形成的二硫键。催化区位于膜表面很近的位置，催化区有两个低聚糖单位，该短糖链的作用可能与限制催化区移动和定位相关^［16］。(www.daowen.com)

BACE的活性受其N端糖基化的影响。糖基化效应是通过促进蛋白折叠，影响蛋白的可溶性、稳定性来调节其活性的。BACE单链跨膜区在位于三个半胱氨酸残基处发生棕榈酰化。这种集中在细胞膜的“脂质筏”的定位对APP的水解起重要作用。

BACE2和BACE1结构相似，只是二者的表达模式、降解APP的位点存在差异。实验证明BACE1在神经元生成Aβ的过程中起主要作用，如脑内BACE1的mRNA表达远高于BACE2表达;在BACE1基因敲除小鼠Aβ产生过程基本消失;基因沉默技术单纯抑制BACE1，β分泌酶裂解APP活性降低^［17］;BACE1作用APP的β分泌酶裂解位点效率高于BACE2。如上述BACE2在Aβ序列的19Phe～20Phe和20Phe～21Ala部位裂解，实际破坏了完整Aβ分子的形成，不能催化Aβ产生。

不同的细胞器内β分泌酶的活性不同，BACE1作用的最适PH值为4.0～4.5，BACE位于分泌途径的酸性亚细胞器中，主要是高尔基体和内质网。内质网中的BACE1在β分泌酶作用位点即AβAsp1处切割APP，最终产生Aβ1-40/ 42。BACE1切割APP的位点是EVKM/DAEF。

有报道显示，BACE1基因剔除鼠的β分泌酶活性丧失，Aβ显著减少，此时动物发育正常，这为Aβ分泌酶作为AD治疗靶点的可行性提供了证据。开发出有临床应用价值的BACE抑制剂，需要药物分子量小于700 kD，IC50较低;应有良好药代动力学特点，亲和力高、低毒性;亲脂性高，容易透过血脑屏障，能获得脑部较高血药浓度，并易于细胞膜结合;高选择性，减少对BACE2的交叉抑制^［18］。

采用抑制β分泌酶治疗策略必需注意到，细胞内其裂解产物sAPPβ和C99的生成减少。而α分泌酶途径的产物P3将增堆积，这些也有可能对机体造成损伤。

三、γ分泌酶

γ分泌酶是一组重要的膜整合蛋白酶，体内具有重要作用，功能较广泛，可以对多种底物进行代谢。APP和Notch等是Ⅰ型跨膜蛋白，γ分泌酶可催化这类底物在延伸细胞膜内序列特异裂解。裂解位点在作用底物的跨膜段，不依赖特定氨基酸序列。γ分泌酶与阿尔茨海默病关系非常密切，在AD的Aβ生成过程中，γ分泌酶有关键作用。

最近研究发现，γ分泌酶是复杂的多亚基复合体，包括NCT、Aph-1、Pen-2和早老蛋白(presenilin，PS)四种蛋白质组成成分。γ分泌酶的蛋白质水解活性位点存在于PS中，其他三种蛋白质为γ分泌酶的辅因子，只有四种蛋白组分同时表达，才能使PS更加稳定，增加完全糖基化的NCT表达，分泌酶的活性才显著增强^［19］。γ分泌酶各组分的结构和功能见表5-4-1。

表5-4-1　γ分泌酶各组分的结构和功能

使人NCT、PS1、Aph-1和Pen-2在酵母菌中外源性共表达，并加入γ分泌酶的底物，可显示有底物的降解，这有力说明了NCT、PS、Aph-1和Pen-2完全可以构成具有活性的γ分泌酶。

γ分泌酶可能的组装模式为:组装过程早期，NCT先与Aph-1形成亚复合体，其中的未成熟NCT在内质网中进行N-糖基化，然后部分新生的PS全蛋白结合于该亚复合体，形成次级过渡态复合体，最Pen-2加入该复合体水解PS全蛋白，形成PS异二聚体，最后γ分泌酶完全成熟^［20］。也有人提出另外的模式。组装完成后γ分泌酶结构见图5-4-1。

图5-4-1　组装完成后γ分泌酶结构图

PS1和PS2是γ分泌酶活性必需的组分。体内研究证明，PS1基因敲除小鼠中，γ分泌酶活性可降低80%，Aβ含量明显降低，而不影响α和β分泌酶活性。如小鼠的PS1和PS2基因双敲除后，将全部抑制细胞γ分泌酶活性。说明PS1是γ分泌酶活性水解APP所必需，形成PS-APP复合物是PS常见存在形式。在γ分泌酶复合体核心中，PS能形成二聚体，可能在两种PS分子的界面裂解其作用底物。

Pen-2也是分泌酶复合体的组分，细胞PS1/ PS2缺乏或NCT水平下调时，都可见Pen-2明显降低。反之，以RNAi技术减少细胞Pen-2水平，则表现PS和NCT水平降低并阻碍γ分泌酶复合体的形成。

nicastrin(NCT)是一种与γ分泌酶及Aβ产生有关的重要蛋白质，在纯化早老蛋白(presenilin，PS)片段时分离发现。NCT也是活性分泌酶复合体必需成分，和γ分泌酶的活性密切相关，其可特异结合γ分泌酶抑制剂。抗NCT的抗体处理除去NCT后，γ分泌酶活性丧失。

成熟NCT属I型跨膜糖蛋白，含709个氨基酸残基，NCT具有l6个潜在的N-糖基化的位点，可形成N-连接糖链。NCT分子结构中，N端信号肽，N端长亲水区域有糖基化、N-豆蔻酰化和磷酸化基团，亲脂跨膜区含20个氨基酸残基，亲水C端短仅含20个残基。

NCT和PS之间存在相互作用。实验显示，PS对NCT翻译后修饰、亚细胞分布及NCT稳定性保持方面都有重要作用。缺乏PS1和PS2时，初级NCT不能到达高尔基器中间膜囊，其末端糖基化的成熟过程不能完成。但PS1和PS2在NCT成熟过程中的作用并不相同。NCT还与PS的表达、稳定及转运有关。

过表达的NCT可以增加Aβ的生成，但不改变PS1表达水平。因γ分泌酶的活性位点在PS蛋白组分，过表达的NCT也不增加γ分泌酶活性。NCT可能是通过调节底物进入γ分泌酶复合体的过程影响Aβ的生成。研究证实，NCT的功能是识别和结合γ分泌酶底物，其能通过胞外功能区作为“γ分泌酶底物受体”，识别Ⅰ型跨膜糖蛋白水解后的氨基残端作为底物^［21］。底物在与NCT初步结合后才进入γ分泌酶活性位点，PS基因某些突变可影响这种结合。

γ分泌酶复合体各种组分的量尚不清楚。γ分泌酶特点，一是γ分泌酶分子底物结合和催化反应的部位是分开的。底物相应定位位点分散。二是对底物的裂解位点显示多样性。包括经典裂解位点在跨膜区段，生成Aβ的羧基端。另外，在接近膜小叶的内部，如Notch位点3裂解，可生成NICD或APP的γ或ε裂解，产生APPICD。

制备γ分泌酶抑制剂以降低减少Aβ42产生的方法受到关注。根据γ分泌酶是天冬氨酰蛋白酶，γ分泌酶抑制剂具有天冬氨酰蛋白酶抑制剂相似的结构特点。如二氟酮处理，可减少Aβ42和Aβ40生成。筛选药物3，5-二甲氧肉桂酰胺-异亮氨-亮氨是二肽醛复合物，对Aβ40的抑制作用强于对Aβ42。这类化学合成药物对AD的疗效，需具有对γ分泌酶特异性，能透过血脑屏障，对中枢神经系统作用有选择性。

由于PS1是维持γ分泌酶活性的重要充分，研究者发现抑制PS1也能降低Aβ42水平。有人在PS1cDNA上选择3个位点和1个错义突变位点，制备相应RNAi，抑制PS1转录表达，可降低Aβ生成。

(崔　行)