艾滋病（AIDS）病毒感染的实验室检测，是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者和艾滋病病人的最基本诊断依据。在实践中，即使有暴露人类免疫缺陷病毒HIV的流行病学史，或有与HIV相关的临床症状，或有与HIV相关的临床疾病综合征，但是缺乏HIV感染的实验室指标，也无法作出HIV／AIDS的诊断。

一、急性HIV感染期

机体暴露于HIV－1～2周后出现急性HIV感染期，持续4～8周。其特征为血液中首先出现病毒血症，从血液中能分离到HIV，检出HIV－RNA和P24抗原，并伴有短暂的CD4T细胞数下降，CD4＋和CD8＋细胞比值倒置，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫反应急剧上升，但血清学HIV抗体呈阴性反应。在感染后期，HIV和P24抗原骤减，检出率明显下降；HIVRNA滴度也开始下降；CD4＋T细胞数复又回升，可恢复到原有水平的80%～90%。重要的是，HIV抗体在急性HIV感染期末已经存在低滴度的抗体，但不能从所有HIV感染者中检出到。主要由于感染者个体之间免疫反应存在极大差异，HIV抗体滴度可相差几倍到10万倍以上，个别的可出现抗体反应；病毒特征也是引起个体间免疫反应差别的因素；尤其是与测试方法有关，例如第1代酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂多数在感染后6～12周才能检出，第2代ELISA间接法最早需感染后3～4周，第3代ELISA夹心法最早需感染后4～7d就能检出，第4代的ELISA抗原抗体联合检测法最早能检出的天数更少。一般来说，95%以上的HIV感染者感染后3～6个月可产生HIV－1抗体。从一个人感染HIV到血清HIV抗体阳转的间隔时间称为窗口期。这个窗口期已被人们越来越关注，可以涉及HIV的传染性和供血者的安全性。

二、潜伏期

急性HIV感染期后进入潜伏期，其最大特点是，由HIV基因蛋白刺激机体产生的HIV抗体反应急剧上升，出现所有HIV结构性抗原蛋白抗体，包括核心蛋白的P15、P17、P24和P55，聚合酶蛋白的P31、P51、P66和膜蛋白的gp41、gp120和gp160。在此期内，难以分离、检出HIV和P24，HIV－RNA滴度也明显降低，但仍维持一定水平。CD4T细胞随着病程的进展逐渐递减。

三、艾滋病期

HIV感染之终，进入艾滋病期，出现HIV大量复制，极易分离到病毒，检出P24抗原，HIV－RNA滴度常呈106～1010。病人CD4T细胞数极度减少，甚至检不出，导致免疫系统衰竭。一般CD4＋T细胞数降至200×106／L以下，则易患致死性机会性感染性与继发性肿瘤。HIV抗体在艾滋病期持续存在，但其效价有所降低，直到晚期核心蛋白抗体明显下降，甚至难以检出。这一时期，HIV在体内高度复制，每天产生上亿个新的病毒颗粒。由于HIV是RNA病毒，在自身复制过程中经常发生“错误”，下一代的病毒都与上一代有细微的差别。其中有些因为“错误”而产生的病毒不能进行自我复制，一段时间以后这些有缺陷的病毒会逐渐消亡，然而也有些病毒因为结构发生变化，即使在高水平抗病毒药物的作用下，反而增加自我复制的能力。因此在服药以后仍然可以继续复制的病毒被称为对药物抵抗（耐药）。据研究人员估计，如果病毒的复制没有受抑制，每天都有可能发生病毒结构的错误，这就是说每天都有可能产生耐药病毒的“种子”。当开始抗病毒治疗以后，这些耐药的HIV在药物存在的情况下仍然很好复制。如果没有进行抗病毒治疗，体内的病毒总数只决定于最“适合”复制自身的病毒，耐药病毒只占病毒总数的很少部分，抗病毒药物使得原来就存在的耐药毒株比对药物敏感的毒株更有优势复制。换句话说，药物本身并不使病毒产生耐药，耐药的毒株在使用药物之前就已经存在，但没有无耐药突变的毒株生长得好。大多数从事艾滋病研究的工作者认为耐药是很多抗病毒药物配方短期有效或者效果局限的主要原因，因为任何时候服药的病人体内病毒仍然在复制，其选择过程意味着耐药毒株迟早会出现。但是“鸡尾酒”疗法能够推迟耐药的出现，因为对一种药物耐药的毒株同样能够被其他几种药物抑制。由此可见，如果药物的作用过于微弱或者病人没有规则地完整服用剂量，任何抗病毒的配方都因为病毒的部分抑制而可能导致治疗失败。因此药物配方抑制病毒复制越完全，则随机产生具有耐药变异的毒株的可能性就越小。也就是说只要药物能够持续抑制病毒复制，则在理论上耐药毒株的出现就能避免；同时耐药毒株的出现避免了，病毒也能够持续被抑制。目前一些“三联”用药方案的研究结果支持上述理论。

一、血清学检测

HIV抗体检测是血清学检测机体内HIV抗体的检测方法，是HIV感染的确诊依据，适用于从HIV感染窗口期后至艾滋病病人死亡的整个过程，是最常用的实验室诊断方法。因母体抗体的干扰，该方法不适用于18个月以下的婴幼儿。血清学检测方法分筛查实验和确认试验两大类。我国要求采供血机构的血液筛查和各医疗卫生机构常规筛查检测宜采用ELISA，在尚未建立艾滋病检测筛查实验室的偏远地区或医疗卫生机构急诊手术、急诊分娩、自愿咨询检测（VCT）或估计难以再次随访到的对象，在规定的场所用快速检测方法进行血液筛查。实验结果阴性，在排除窗口期后可报告无HIV感染；对呈阳性反应的抗体，应进行复检，采用原有试剂和另一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病检测确证实验室进行确认，这是由于HIV抗体筛查呈阳性反应的标本可能存在假阳性。确认试验方法有多种，包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验、免疫荧光试验和放射免疫沉淀试验，其中以WB最为常用。WB试剂有HIV－1／2混合型和单一型两种。实验结果应按《全国艾滋病检测技术规范》要求并参照所用试剂说明书结合判定：无HIV抗体特异带出现的，报告HIV抗体阴性；出现HIV抗体特异带又符合HIV－1抗体阳性判定标准的，则报告HIV－1抗体阳性。如出现HIV－2型的特异性条带，需用HIV－2免疫印迹试剂再做单一HIV－2抗体确定试验，呈阴性反应，报告HIV2抗体血清学阴性，呈阳性反应的，则报告HIV－2抗体血清学阳性，如需鉴别应进行核酸序列分析。如果出现HIV抗体特异带，但带型不足以判定阳性的则判定为HIV抗体不确定，应建议3个月后进行随访，再次进行血清学检测。

二、病毒学检测

病毒学检测是直接检测HIV的方法，包括分离病毒、亚型分析、检测病毒核酸和抗原，可用于HIV感染之初抗体出现前的早期诊断和18个月以下婴幼儿的诊断。

（一）病毒分离

病毒分离培养即将采集到的HIV感染者或者艾滋病病人外周血单核细胞接种到人类白细胞或其他细胞进行培养，产生成千上万个病毒颗粒，然后测定病毒培养上清液中HIV反转录酶或P24抗原。培养与分离HIV，这是HIV病毒学的基础工作，既可提供初期感染和艾滋病阶段的诊断依据，又可及时为HIV母婴传播的婴儿作出及早诊断；又是提供药物筛选用的毒株来源，以及研究病毒变异和亚型分析的基础工作。HIV分离试验结果阳性，是确定HIV感染的最直接证据，但实验结果阴性不能排除HIV感染。这是由于HIV感染后临床各阶段病毒的分离率相差悬殊，以至于敏感性较低，再则此方法技术上要求高，操作复杂，费用昂贵，采集、运输标本严格，需要在P3级生物安全实验室内进行，不适宜临床常规使用。

（二）HIV亚型分析

这主要是针对HIV－1毒株不同亚型的测定。全球已有三大群，即M群（含9个亚型）、O群和N群，基本上分析gp120V3区的不同基因构成。对于了解一个地区HIV流行的自然史十分重要，同时也可供临床学、流行病学调查研究分析。我国已发现至少有A、B、C、D、E和F6个亚型，其测定方法主要采用分子杂交试验。

（三）HIV核酸检测

通常是检测HIV－RNA，有定性检测和定量检测两种。

1．HIV核酸定性检测　可用于HIV感染的辅助诊断，通常使用聚合酶链反应（PCR）或反转录PCR（RT PCR）技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量覆盖所有或常见的毒株，也可使用复合引物。实验结果阴性，只报告本次实验阴性，但不能排除HIV感染；实验结果阳性，可作为HIV感染的辅助诊断指标，尤其年龄＜18个月龄婴幼儿两次核酸检测均阳性可作为HIV感染处理，但到18个月龄后宜做HIV抗体检测；核酸定性实验结果阳性不能单独用于HIV感染的诊断。每次报告核酸定性检测结果时应注明反应条件和使用引物的序列。

2．HIV核酸定量检测　是用一定方法测得机体内出现的病毒数量，称为病毒载量（virlload），常用每毫升人体血液中检出病毒核酸拷贝数来表示。近年来，也有方法采用国际单位IU／ml表示。HIV－1核酸定量检测方法有核酸序列实验（nucleic acid sequence based assay，NASBA）、RT PCR、分支DNA杂交实验（bDNA）、HIV巢式PCR微流芯片实验等。目前公认根据HIV感染者血清阳转6个月内的病毒载量数可以估计其今后疾病发展速度。该方法灵敏性较高，但要求实验室条件完备以防止假阳性出现，需要有专门设备，试剂盒也相当昂贵。

HIV核酸定量测定具有早期诊断意义。在HIV感染的窗口期，抗体检测不出或出现不确定的反应时，病毒载量的测定可提供非常有用的证据。这有利于对血清阳转前标本的检测和HIV阳性母亲所生婴儿的HIV感染确定。尤其年龄＜18个月龄婴幼儿HIV核酸定量检测每毫升在10000拷贝以上时应作为HIV感染处理。早期病毒载量测定，对于及时检出窗口期感染个体，并及时进行干预，减少传播具有特殊的意义。

HIV核酸定量测定可对HIV感染者和艾滋病病人进行病程监控。一个人感染HIV后，其HIV病毒载量具有一定的变化规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此，定期进行病毒载量的检测可以帮助医师和感染者确定疾病发展的阶段，以进行相应的治疗。有研究显示，病毒载量的固定值水平与HIV感染进展速率存在相关关系，并且这种关系是独立于CD4＋T细胞的。观察感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。一项研究结果表明：病毒载量与6年发病率的关系为：＜500拷贝／ml时为5．4%；501～3000拷贝／ml时为16．6%；3001～10000拷贝／ml时为31．7%；10001～30000拷贝／ml时为55．2%；＞30000拷贝／ml时则为80%。

HIV核酸定量测定可作为疗效判定和提示耐药线索，指导医师制订治疗方案。临床实践证明，通常在病毒载量达到一定的水平后（如＞35000～50000拷贝／ml）治疗才具有更好的效果。另外，在进行治疗后，通过病毒水平的检测能确定此前的治疗是否有效。通常在治疗后2～4周病毒水平降低50%（0．3log10）才被认为临床有效。当发生下列情况之一时，应考虑治疗失败或有可能产生耐药性，提示进行耐药性检测，从而调整治疗方案：经高效抗病毒治疗8周后，血浆中病毒载量比原水平降低没有超过1．0log10；经高效抗病毒治疗6个月后，血浆中病毒载量没有降至“测不出”的水平（50拷贝／ml）；血浆中病毒载量经高效抗病毒治疗已达到“测不出”的水平后又出现上升，提示出现了耐药；除外并发感染、疫苗接种和检测方法的改变，血浆病毒载量从最低点上升3倍或更高。

HIV核酸定量检测结果应按照仪器数据报告结果，注明使用的试验方法、样品种类和样品量以及最低检测限的水平，低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。

（四）检测HIV感染抗原

一般用FDA注册批准的ELISA双抗体夹心法试剂测定P24抗原，阳性结果必须经中和试验确认，才可提示为HIV感染。一般用于HIV－1抗体不确定或窗口期的辅助诊断，也可用于HIV－1感染者或艾滋病病人母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断，也可作为第4代HIV－1抗原／抗体联合检测酶标试剂检测呈阳性反应而HIV－1抗体免疫印迹法试验阴性样本的辅助诊断。但是HIV－1P24实验结果阴性，不能排除HIV感染，因为该实验的敏感度一般为30%～80%。

三、检测免疫功能标志物

在HIV感染与疾病过程中，免疫功能标志物对确定诊断、了解病程进展、评估药物疗效是一项十分重要的指标。这些指标包括CD4淋巴细胞、CD8淋巴细胞、CTL、β2微球蛋白和新蝶呤（Neopterin）和协同受体CCCR5、CXCR4，但是目前在临床上常用的是CD4淋巴细胞，因为其为HIV攻击的主要靶细胞，是HIV进入机体主要受体位点，检测CD4淋巴细胞可以提供HIV感染者的免疫状态，预测疾病进程和确定抗病毒治疗的基本准入条件，以及评估药物疗效的可靠指标。流式细胞仪是检测CD4＋T细胞数的标准方法，可以得出CD4＋T细胞占淋巴细胞的比值和绝对值。我国HIV／AIDS诊断标准中提出在成人和青少年CD4细胞≥500× 106／L，提示无免疫抑制；350～499×106／L，提示轻度免疫抑制；200～349×106／L，提示中度免疫抑制；＜200×106／L，提示重度免疫抑制；在婴幼儿CD4细胞百分比＞35%（年龄＜12月龄）或20%～24%（1～5岁）提示无免疫抑制；25%～34%（年龄＜12月龄）或20%～24%（1～5岁）提示轻度免疫抑制；20%～24%（年龄＜12月龄）或15%～19%（1～5岁），提示中度免疫抑制；＜20%（年龄＜12月龄）或＜15%（1～5岁），提示重度免疫抑制。以上数据不仅反映HIV感染的病程进展，而且已作为艾滋病临床分期的重要依据。业已证明，HIV感染者和艾滋病病人CD4＋T细胞数和HIV载量呈负相关，即随着免疫状态低下，CD4细胞数下降，而病毒载量上升。因此，无论是否进行抗病毒治疗的HIV感染者，最好在诊断为HIV感染时同时检测CD4＋T细胞绝对值和HIV核酸病毒载量，以后根据要求每3～6个月或1年重复检测一次。如条件受限，至少检测CD4＋T细胞数，以便对HIV感染者及时进行抗病毒治疗。必须指出的是，不论CD4＋T细胞数或HIV核酸定量检测，对同一对象宜采用同一方法、在同一实验室内进行，以避免差异性。

四、检测耐药性

HIV具高度变异性是其一大特征，尤其随着国内外艾滋病抗病毒治疗的开展，病毒变异和耐药株正在不断出现，甚至一个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药，导致治疗的失败，尤其是我国政府颁布了“四免一关怀”政策后，对耐药性监测予以高度重视。事实上，耐药突变中在未进行抗病毒治疗的HIV感染者中也有发生。HIV耐药分为原发性和继发性两种，前者指直接影响抗病毒药物作用靶点的变异，造成复制关键酶的改变；继发性变异又称为补偿变异，常出现于原发性变异已存在的病毒基因组中，提高病毒的耐药性，对原发性变异起到保护作用。

目前常用的耐药性检测有2种方法，即表型HIV耐药性检测和基因型HIV耐药性检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，测量需要多大浓度的药物剂量才能将病毒复制抑制在50%或者90%水平（IC50或者IC90）。但不足的是试验耗时又昂贵，技术要求高。基因型检测是通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变，即在HIV反转录酶基因区或者蛋白酶基因区寻找与耐受关联的特殊突变位点。由于全球已建立起若干个耐药检测数据库，便于对实验结果正确分析，而且这种检测方法历时较短，费用较低，技术也相对容易。

为了更好地开展我国艾滋病治疗的耐药监测，自2004年起由卫生部指导建立了以中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国医科大学、军事医学科学院和上海市疾病预防控制中心4家单位为核心实验室的全国HIV耐药性监测网络，最近已被认可为世界卫生组织HIV耐药监测网络成员。该网络已系统地进行治疗地区HIV耐药毒株的动态横断面调查，包括流行病学调查和实验室检测，及时掌握耐药毒株出现的情况以及影响因素，为制定合理的用药方案和减少耐药毒株的出现提供科学依据，为国家抗HIV治疗提供技术保障，为全国开展耐药检测工作提供技术支撑。

一、HIV抗体测定

（一）筛查试验方法

目前国内外用于HIV抗体筛查的方法很多，根据检测原理不同可分为ELISA、凝集法和免疫层析法；按检测速度与设备需求，又可分为常规法和快速法。在实际工作中常用的筛查试剂为ELISA、明胶颗粒凝集试验和各种反转录酶（快速诊断试剂）。我国规定筛查试剂必须是HIV－1／2混合型，经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。自1985年第1代ELISA试剂问世以来，随着医学技术的飞速发展，包被抗原和测试方法的不断改进，包被抗原已从第1代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组与多肽抗原包被和标记的有着良好敏感性和特异性的第3代双抗原夹心试剂，检测亚型包括HIV－1、HIV－2和HIV－1的O亚型，窗口期由原来的10周缩短至3～4周。为避免窗口期传染，荷兰、法国等国已研制出可同时检测抗原抗体的第4代ELISA筛查试剂，第4代ELASA筛查试剂更可缩短窗口期，但其临床价值有待评估。

目前，国内外主要使用第3代ELISA试剂（双抗原夹心ELISA），少数使用第2代试剂。血源筛查仍以第3代ELISA为主，但国际上有些国家和地区已将第4代ELISA试剂用于血源筛查。

随着对HIV感染者和艾滋病病人抗病毒治疗的进展以及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要有凝集试验、斑点免疫胶体金试验及免疫层析试验。

除了最常用的血液样品外，唾液、尿液等样品也可用于HIV抗体检测。1996年，美国食品药品管理局（FDA）首次批准HIV－1尿液ELISA试剂。我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDU）人群和其他高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。艾滋病唾液检测卡是在硝酸纤维素膜上包被人工合成的HIV－gp41／gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV－1／HIV－2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV－IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长，且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、WB试剂已经美国FDA批准。

（二）确认试验

确认试验主要包括WB、线性免疫试验（line immuno assay，LIA）、放射免疫沉淀试验（radio immuno precipitation assay，RIPA）及免疫荧光试验（immuno－fluorescence assay，IFA）。目前国内最常用的是WB。我国规定进行确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。

1．WB WB是广泛用于许多传染病诊断的试验方法，就HIV的病原学诊断而言，它是目前使用最多的HIV抗体确认试验。WB的敏感性一般不低于筛查试验，但它的特异性很高，这主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化，能够检测针对不同抗原成分的抗体。WB技术主要包括3个部分：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）将HIV抗原按照分子量大小而分离；将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上；加样检测标本中是否含有针对不同抗原组分的抗体。原理和操作类似于ELISA间接法，区别只在于WB的抗原是分开的而不是混合的。WB结果显示的是不同抗原组分的抗体，因而更具有特异性。应注意的是，尽管病毒经过浓缩和纯化，条膜上仍然可能含有病毒赖以生存的宿主细胞成分，导致非特异性反应，它们大多出现在中分子量区域。

WB试剂盒有HIV－1／2混合型（条膜上包被有HIV－1病毒抗原和一条HIV－2合成肽）和单一的HIV－1或HIV－2。HIV－1抗体特异带包括env带：gp160／gp120、gp4l；gag带：P55、P24、P17（或P18）；pol带：P66（或P65）、P51、P31。HIV－2抗体特异条带包括env带：gp140／gp105、gp36；gag带：P56、P26、P16；pol带：P68、P53、P34（由于使用的毒株不同，HIV－2env带也可为gp125／gp80、gp36）。

2．LIA WB的缺点之一是在某些情况下产生大量的不确定结果，新1代基于重组蛋白和（或）合成肽的试剂盒（一般称为LIA）可大大减少这种不确定结果。LIA是将HIV的重组蛋白和合成肽以及质控带包被在尼龙膜条上，用于检测样本中的HIV－1和（或）HIV2抗体。该法可将HIV不同型及亚型的特异性抗原同时包被在一条膜上，在检测抗体的同时还能区分HIV－1和HIV－2感染。已商品化的试剂盒有INNO LIA、Pepti Lav和 RIBA等。

3．IFA IFA以固定于玻片上感染细胞内的HIV作为抗原，与待检血清反应后，加入荧光素标记的抗人免疫球蛋白，洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下观察结果，胞质内出现特异性荧光，而对照孔没有特异性荧光，就可诊断为HIV抗体阳性。IFA操作的技术要点是检测之前玻片要在室温下开启，避免因凝结而造成细胞溶解。操作类似于间接ELISA，应避免直接接触细胞层以免损伤细胞，避免同一玻片孔与孔之间的交叉污染等。

IFA曾被FDA推荐用于WB不确定样品的诊断，但需要昂贵的荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人员，对结果的观察和解释易受主观因素的影响，结果也不宜长期保存。IFA不宜在一般的实验室开展和应用。

（三）常用检测方法的原理和基本检测程序

根据《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版）的要求和检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检），目前大量使用ELISA作为初筛实验，将WB作为确认方法。现举法国生物梅里埃公司生产的Vironostika HIV－Uni formⅡplus0酶标试剂、日本富士公司生产的PA明胶颗粒凝集试剂、日本Dainabot有限公司生产的Determine HIV－1／2抗体快速层硒法试剂、韩国SD公司生产的第3代一步法HIV－1／2抗体胶体金法试剂、新加坡MP生物医学亚太有限公司生产的HIV－1＋2抗体免疫印迹试剂（HIV－BLOT 2．2）原理和基本检测程序如下。1．Vironostika HIV－Uni formⅡplus0酶联免疫吸附试验

1）原理Vironostika HIV－Uni formⅡplus0是基于一步“夹心法”原理的ELISA的试剂。在微板的孔壁上包被着HIV抗原混合物：HIV－1P24、HIV－1gp160、HIV－1ANT70合成肽和HIV－2env合成肽（氨基酸592～603），每个微板孔内放置一个由HRP标记的相同抗原的球状复合物。首先加入到微板孔内的标本稀释液会溶化球状抗原复合物，然后，加入实验标本或适当的含有HIV－1、HIV－2或HIV－1O亚型抗体的阳性对照，进行温育。如果存在HIV－1、HIV－2或HIV－1O亚型抗体，就会形成一个“固相HIV抗原抗体酶标记抗原复合物”。随后进行洗板和加入作为底物的四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物混合，进行温育，加入H2SO4终止反应，有颜色变化的微板孔将变为黄色。如果标本中含有HIV－1、HIV－2和（或）HIV－1O亚型的抗体，将有明显颜色变化。当标本中没有HIV抗体时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化。最终在酶标仪上读取结果。

2）基本检测程序

（1）加样：在所有的板孔中加入100μl的标本稀释液（包括要做质控的板孔），再加入50μl的标本或质控。每一微量板架应包括3个阴性对照和1个HIV－1阳性对照，若需要可加1个HIV－2阳性对照。在加入标本之后加入质控。在未使用的板孔中加入标本稀释液，用以溶解每个复合物球，以确保洗板机不会受到损坏。

（2）孵育：在微板上盖上贴膜。35～37℃中温育1h。

（3）洗板：温育完毕后，立即使用磷酸缓冲液冲洗和浸泡每孔6次。

（4）显色：在进行温育的过程中，配置洗涤液和准备充足的TMB底物液。TMB溶液和TMB底物液应避光保存。每一孔加入100μl TMB底物液。避光，在18～25℃环境中温育30min左右。

（5）终止反应：孵育完毕，在每一孔中加入100μl 1mol硫酸，终止反应。确保充分混匀，可通过轻拍微量板架的边。应在2h内进行读数。

（6）在450nm单波长读取每一孔的吸光度或在450nm和660nm参照波长（双波长）读取每一孔的吸光度。

（7）结果判断和分析：NC＝阴性对照的吸光度；PC1＝HIV－1阳性对照的吸光度；PC2＝HIV－2阳性对照的吸光度。

阴性对照的要求：

NC必须＜0．250。去除所有NC≥0．250。

确定NC的均值（NCx）。

NC必须在NCx的0．6～1．4倍。去除所有NC＜0．6NCx或NC＞1．4NCx。

如果任一NC被去除，需要重新计算NCx。

实验的有效性须满足下列条件，实验有效：

保留有一半或以上阴性对照。

PC1NCx≥0．400。

PC2NCx≥0．400（如果使用）。

临界值（CUTTOFF）：

如果实验是有效的，计算临界值＝NCx＋0．100。

如果标本的吸光度≥临界值，则实验的标本呈阳性反应。

如果标本的吸光度＜临界值，则实验的标本呈阴性反应。

2．日本富士公司生产的PA明胶颗粒凝集试剂

1）原理　本品是一种用来检测HIV－1／2抗体的体外诊断试剂。它是将重组HIV－1抗原（HIV－1／gp41和HIV－1／P24）和HIV－2抗原（HIV－2／gp36）包被在人工载体明胶粒子上。这些致敏粒子和血中的HIV－1或HIV－2抗体进行反应发生凝集（particle agglutination test，PA法），由此可以检测出血清和血浆中的HIV－1／2抗体。

2）基本检测程序

（1）按说明要求，配制致敏粒子和对照粒子，充分混匀，待用。

（2）稀释样品：加3滴（75μl）样品稀释液于“U”形反应板第1孔。第2、第3孔分别加入一滴样品稀释液（25μl）。用微量移液器取25μl待检样品至第1孔中，充分混匀，然后用微量移液器取25μl至第2孔，充分混匀，再移25μl到第3孔充分混匀后，移弃25μl。为准确起见，阳性对照试验应与样品试验平行进行。

（3）用试剂盒中提供的滴管在第2孔中滴入1滴（25μl）对照粒子，在第3孔中滴入1滴（25μl）致敏粒子。

（4）用平板混合器以不会导致微量反应板内容物溅出的强度混合30s，加盖后于室温（15～30℃）下水平静置。2h后观察结果。

（5）结果判定标准

阴性：粒子成纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。

可疑：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。

阳性：粒子形成大环状，其外周边缘也不均匀且杂乱地凝集在周围。

强阳性：产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。

（6）结果判定

阳性：对照粒子（最终稀释倍数1∶16）的反应图像判定为（－），致敏粒子（最终稀释倍数1∶32以上）的反应图像判定为（＋）时，最终判定为阳性。

阴性：无论对照粒子呈现何种反应图像，只要致敏粒子（最终稀释倍数1∶32）的反应图像显示为（－）时，最终判定为阴性。

保留：对照粒子（最终稀释倍数1∶16）的反应图像判定为（－），且致敏粒子最终稀释倍数1∶32）的反应图像判定为（±）时，最终判定为保留。

（7）重吸收试验：对于对照粒子和致敏粒子均显示（±）或阳性以上的样品，应进一步做如下重吸收试验。

3．韩国SD公司生产的第3代一步法HIV－1／2抗体胶体金法试剂

1）原理　本品采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化HIV－1基因重组抗原（gp41、P24）及HIV－2基因重组抗原（gp36），分别固定于硝酸纤维膜上，作为检测线1和检测线2，并且用这3种抗原标记胶体金。当待检标本中存在HIV抗体［1型和（或）2型的IgG、IgM或IgA］时，即和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿醋酸纤维膜向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成AgAb Ag Au复合物而富集在包被线上，形成1条或2条紫色沉淀线，是阳性结果。反之，若标本中不存在HIV抗体，则不会出现紫色条带，是阴性结果。本品适用于血清、血浆及全血中的HIV或HIV－2抗体的检测。

2）基本检测程序

（1）样本检测：缓缓滴加10μl待检样本于样品孔中，然后滴加3滴样品稀释液。此时，在检测板中央区域可看到紫色液体流过结果窗口。

（2）5～20min内判读结果并记录试验结果，超过20min观察无效。

（3）结果判定标准：①在结果窗口的左侧，将出现1条紫色条带，称为质控带。此条带的出现说明测试正常，若没有出现则测试失效。②结果窗口的右侧显示检测结果，若出现1条或2条紫色条带，则是阳性结果。③阳性结果：在结果窗口中存在不少于两个色带（1，2带或C带），不管哪一个带先出现，分别表明HIV－1和（或）HIV－2的阳性结果。④阴性结果：仅结果窗口质控线（C）位置上出现1条紫红色条带。⑤无效结果：在试纸条／板的检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带。

4．新加坡MP生物医学亚太有限公司生产的HIV－1＋2抗体免疫印迹试剂（HIVBLOT 2．2）

1）原理　WB是将HIV蛋白经SDS PAGE，由于蛋白分子大小不同而分离开来，然后再把这些已分离的不同蛋白带转移到硝化纤维膜上，以后用不同的方式，包括非常敏感的免疫酶法，检测HIV抗体。每一条硝化纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV抗原。若有相应抗体就会与硝化纤维膜条上的抗原带相结合。然后与抗人的IgG酶结合物反应。在底物作用下，硝化纤维膜条带上呈现紫色，表示阳性反应。

2）基本检测程序

（1）准备试剂：配制稀释洗涤液、印迹缓冲液、工作酶结合溶液。

（2）湿润膜条：用镊子从塑料管中小心取出所需的硝化纤维膜条，其中包括3条对照（强阳性、弱阳性、阴性对照各1条），并且将有编号的膜面向上放入分析槽中，随后加入2ml已经稀释好的洗液，室温（22～28℃）振荡浸泡至少5min，然后吸干槽内液体。

（3）加样：每槽中加入2ml印迹缓冲液和20μl待检标本或对照血清（每个标本都需换新的移液头）。

（4）孵育：盖上盖子，室温振荡1h（也可采用室温振荡16～18h）。

（5）洗涤：小心打开盖子，吸干槽内液体，避免标本交叉污染。加入2ml已经稀释的洗涤液，室温浸泡振荡5min，再吸干槽内液体。如此反复洗涤3次。

（6）酶结合：加入2ml工作酶结合溶液，盖上盖子，室温振荡1h（如果在6步骤中采用室温振荡16～18h的，则此步酶反应步骤中室温振荡30min）。

（7）洗涤：吸干槽内液体，再洗涤3次。

（8）显色：加入2ml底物溶液，室温振荡15min。

（9）终止：吸干槽内液体，加入蒸馏水终止反应，反复3次，随后用镊子小心取出膜片于滤纸巾上，并开始读膜片结果。

（10）结果判定标准：每次实验须设立对照血清，如阳性对照必须全部条谱带均出现；弱阳性对照可以谱带不全，但必须够判定阳性的结果；阴性对照则无反应谱带。如果对照血清的结果未出现正确的谱带，则此次实验无效，须重做。同时，每条膜片上有一血清条带，此带未出现说明有可能漏加标本，那么此条带为无效实验，也须重做。

（11）结果判定：阴性标本，在膜片上不出现有颜色的谱带。阳性血清标本可在膜上呈现水平的深紫色谱带。小分子量蛋白谱带在膜片下端，高分子量的谱带在膜片上端。谱带颜色的深浅与血清中HIV抗体的浓度呈正比。典型的反应谱带可参照标准图谱判断（试剂盒中备有）。

中国疾病预防控制中心2004年版的《全国艾滋病检测技术规范》WB检测的判定标准如下。

HIV－1抗体阳性：至少有2条env带（gp41和gp160／gp120）出现；

至少有1条env带和P24带同时出现。

HIV－1抗体阴性：无抗体特异带出现。

HIV－1抗体不确定：出现HIV特异性抗体带，但带型不足以确认阳性的。

上述标准为判读WB检测结果的基本原则，在实际工作中还应参照所用试剂的说明综合判断，遇疑难情况应报上级实验室解决。

如膜片上出现特异性HIV－2gp36带，则须进一步用检测HIV－2抗体的WB药盒进一步检测。HIV－2抗体血清学阳性：至少有2条env带（gp36和gp140／gp150）。HIV－2抗体阴性和HIV－2抗体不确定的判断，类同于HIV－1的判断。

（四）常规HIV抗体检测程序

1．筛查实验

1）初筛试验　血液标本验收合格后，用初筛检测试剂进行检测，如呈阴性反应，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。

2）复检试验　对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。

3）筛查试验结果的报告　对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告。

4）筛查试验呈阳性反应样品的转送　如需送上级实验室进行复测或确认，需要填写“HIV抗体复测送检单”，经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。

2．确认实验

1）复核　将初筛实验室检测呈阳性反应的标本，连同新采集的血液标本，同时用两种高质量的初筛试剂复核。如均呈阴性反应，并与初筛检验人员共同研究复核检测结果，确定无误后，则作阴性报告，不必做WB。只要任何一种试剂检测结果呈阳性反应，须用WB证实。

2）确认试验由确认实验室根据检测结果出具“HIV抗体确认检测报告单”，报告HIV抗体阳性（＋）、HIV抗体阴性（－）及HIV抗体不确定（±）。

3）符合HIV－1抗体阳性判断标准，报告“HIV－1抗体阳性（＋）”，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。

4）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（±）”，在备注中应注明“3个月后复检”，同时进行以下处理。

（1）随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时暴露时间已超过3个月，则在3个月后随访1次即可。将前后2份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则报告HIV抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则报告HIV－1或HIV－2抗体阳性。

（2）必要时可做HIV－1P24抗原或HIV核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。

5）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（－）”。如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除因窗口期而出现的假阴性结果，建议高危行为后3个月时再做抗体检测。也可进行HIV－1P24抗原或HIV核酸检测，作为辅助诊断。

6）如果出现HIV－2的特异性指示条带，需用HIV－2WB试剂再做HIV－2的抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV－2抗体阴性；呈阳性反应则报告HIV－2抗体血清学阳性，并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析；呈不确定反应，则进行随访。

7）省艾滋病确认中心实验室难以确认的样品，送国家艾滋病参比实验室确认。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确认结果时，由国家艾滋病参比实验室和艾滋病确认实验室审评及技术指导专家组予以仲裁。

（五）HIV抗体检测的替代策略

除上述常规检测程序以外，可以根据不同的目的，对HIV流行强度不同的地区和不同人群采用不同的替代策略，见表10-1。

表10-1　HIV抗体检测的替代策略

1．替代策略Ⅰ（HIV感染疫情报告检测策略）

1）适用范围　全国HIV感染疫情报告。

2）检测程序和结果报告　先用一种筛查试剂检测，出现阴性反应则报告“HIV抗体阴性”。出现阳性反应则用两种不同原理或不同厂家的试剂复测（其中包括进口第3代ELISA试剂）。两种试剂复测均为阳性，且其中第3代ELISA试剂复测样品OD值与临界值（cutoff）的比值（S／CO）≥6．0者可作阳性考虑，上报疫情。两种试剂复测结果均为阳性，但第3代ELISA试剂复测S／CO比值为1．0～5．9或两种试剂复测结果呈一阴一阳，应进一步做确认试验，按照确认试验的标准判断结果。

2．替代策略Ⅱ（高危人群VCT检测策略）

1）适用范围　HIV感染高流行地区高危人群的自愿咨询检测。

应在确认中心实验室和确认实验室或上述实验室指定的筛查实验室进行，用高质量筛查试剂检测及判断结果。使用该策略判断结果，阳性报告须由确认中心实验室和确认实验室或上述实验室认可的筛查实验室出具。

2）检测程序和结果报告　先用第1种筛查试剂（ELISA 1）检测，出现阴性反应报告“HIV抗体阴性”。出现阳性反应则报告“HIV抗体待复查”，并用第1种酶联试剂（ELISA1）和第2种酶联试剂（ELISA 2）复检。两种ELISA试剂检测结果均阴性则报告HIV抗体阴性；两种ELISA试剂检测结果均阳性，且S／CO比值均≥6．0者，用第3种筛查试剂（高特异性筛查试剂）检测。如果第3种试剂检测结果为阳性，在符合使用该策略条件的地区和人群中可以出具“HIV－1抗体阳性（＋）”报告，使用“HIV抗体替代策略检测报告单”。同时上报疫情，做好检测后咨询。

两种ELISA试剂检测结果一阴一阳、两种ELISA试剂检测结果均阳性但1种或2种S／CO为1．0～5．9、第3种筛查试剂检测结果为可疑或阴性，则均需做确认试验，按照确认试验的结果出报告。同时上报疫情，做好检测后咨询。

3．替代策略Ⅲ（一般人群自愿咨询检测策略）

1）适用范围　HIV高流行地区一般人群检测及其他地区各类人群的自愿咨询检测。

2）检测程序及结果报告　先用一种高敏感性筛查试剂检测，出现阴性反应报告HIV抗体阴性；出现阳性则用第2种筛查试剂（高特异性）复检。第2种筛查试剂检测阴性则用第3种筛查试剂（另一种高特异性试剂）检测；第2种筛查试剂检测为阳性则按疑似阳性咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。第3种筛查试剂检测为阴性则报告HIV抗体阴性；第3种试剂检测为阳性按疑似阳性咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。同时上报疫情，做好检测后咨询。

二、HIV核酸检测

（一）核酸定量测定（即病毒载量）

目前全球主要采用基因扩增（PCR）或信息扩散（bDNA）两大类方法来判定血浆或血清中HIV颗粒的含量，可以直接反映HIV－1的复制情况。前一种方法的敏感性优于后一种，但后一种检测操作简便，由于省去基因扩增步骤，假阳性概率大大减少。最好在同一病人或感染者不同时间采用同一方法进行比较。目前根据上述原理，在市场上供应的有罗氏公司Amplicor HIV－Monitor（RT PCR）和生物梅里埃公司的NASBA（nucleic acid sequence－based amplication）和贝尔公司的bDNA。

1．Amplicor HIV－1Monitor（COBAS）实验

1）原理　COBAS是基于目标HIV－1RNA的cDNA的PCR。用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，用异丙醇沉淀核酸，使用热稳定重组的、具有反转录酶和DNA聚合酶活性的rTth DNA聚合酶，反转录和PCR一步完成。在生物素标记的HIV－gag区引物、rTthDNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷和合适的缓冲液成分存在的条件下，cDNA被扩增到非常高的拷贝数。将扩增产物变性，单链DNA与微孔板上包被的HIV特异性寡核苷酸探针结合，然后加过氧化物酶标记的亲和素，与生物素标记的扩增产物结合，在加入HRP特异的显色底物以后就可以确定扩增产物的数量。将已知拷贝数的HIV－1定量标准品加到每一个样本中和HIV－1靶序列一起共同进行样本制备、反转录、PCR扩增、杂交和检测，并和HIV－1靶序列一起扩增。COBAS AMPLICOR分析仪根据HIV－1定量标准品的数据计算每一个样本HIV－1RNA的含量。实验使用已知浓度的内部定量标准，在提取RNA之前加到每份标本中，既可以定量标本中的HIV－RNA，又可以弥补血浆中存在的影响提取和扩增的抑制因子。

该检测试剂盒可以通过两种样本处理程序进行检测，即标准的和极度敏感的操作步骤（standard and ultrasensitive procedure），定量测定含量为50～750000拷贝／ml HIV1RNA。

2）基本检测程序

（1）试剂准备（在扩增前区—试剂准备区完成）

配制工作主反应液：确定病人样本和质控需要的A ring数量。将100μl HIV－1Mn2＋，v1．5加到一瓶HIV－1MMX，v1．5中制备成工作主反应液。颠倒混匀10～15次。用连续分配器或者使用带滤芯或正压置换吸嘴的加样器将每一个A-tube中加入50μl工作主反应液。此时不要盖上A tube的盖子。将装有工作主反应液的A ring放到可反复封口的塑料袋中，并将口封严。将A ring带到扩增前区—样本制备区。在扩增前区—样本制备区将装有工作主反应液的A ring保存在2～8℃直到样本和质控物制备完成。

（2）标准的样本和质控制备（在扩增前区—样本和质控制备区完成）：将2．0ml螺口离心管编号，每份样本一个离心管，另外再标记3个离心管用于“HIV－1（－）C”、“HIV－1L（＋）C”和“HIV－1H（＋）C”。

制备标准工作裂解液：先混悬振荡HIV－1QS，v1．5至少10s，每一批样本和质控共12份则加100μl HIV－1QS，v1．5到一瓶HIV－1LYS中并混匀。然后加600μl工作裂解液到每一个标记的离心管中。

制备标准的质控：先混悬振荡NHP，将200μl正常人阴性血浆（NHP）分别加到标记了HIV－1（－）C、HIV－1L（＋）C和HIV－1H（＋）C 3个质控管中，盖上管盖并混悬振荡3～5s。然后每管对应加入50μl已振荡混匀的HIV－1（－）C、HIV－1L（＋）C和HIV－1H（＋）C，盖上管盖并混悬振荡3～5s。200μl病人样本则加到相应标记并已加有裂解液的管中，盖上管盖并混悬振荡3～5s。将样本和质控室温温育10min。

将每个样本和质控管加入800μl 100%异丙醇（室温下），重新盖上管盖剧烈混悬振荡3～5s。不要同时打开一个以上的管盖。每个管子做定向标记并在将管子放入离心机时是标记朝向外侧，这样可以使沉淀位于做标记的一侧。室温下最大速度（12　500～16000g）离心样本和质控15min，吸弃上清。再每管加入1．0ml 70%乙醇（室温下），重复上述步骤混悬、离心5min和吸弃上清。

溶液提取的RNA：每个管中加400μl HIV－1DIL，盖上管盖。剧烈震荡10s。使用带滤芯或正压置换吸嘴的加样器，取50μl处理好的样本和质控加到相应的已加有工作主反应液的A tube中，盖好A tubes。将已加有样本和质控的A ring带到扩增／检测区。

（3）极度敏感的样本和质控制备

超高速低温离心沉淀病毒颗粒：将1．5ml螺口离心管编号，每份样本使用一个离心管，另外再标记3个离心管用于“HIV－1（－）C”、“HIV－1L（＋）C”和“HIV－1H（＋）C”。加500μl病人样本到相应标记的管中。然后再加500μl NHP到每一个相应标记的质控管中。每个管子做定向标记并在将管子放入离心机时标记朝向外侧，这样可以使沉淀位于做标记的一侧。在2～8℃，以速度23　600g离心样本和质控60min。

裂解病毒颗粒：弃去上清，加600μl工作裂解液到每一个标记的管子中并盖好盖子。混悬振荡3～5s，使沉淀物复溶。

制备极度敏感的质控：混悬振荡NHP，HIV－1（－）C、HIV－1L（＋）C和HIV－1H（＋）C 3～5s。将12．5μl HIV－1（－）C、HIV－1L（＋）C和HIV－1H（＋）C分别加到对应的标记有“HIV－1（－）C、HIV－1L（＋）C和HIV－1H（＋）C”并已加有极度敏感工作裂解液的管中，盖上管盖并混悬振荡3～5s。然后样本和质控室温温育10min。

上述样本和质控中均加入600μl 100%异丙醇（室温下），重新盖上管盖剧烈混悬振荡3～5s，然后定向标记离心15min（12　500～16000g），这样可以使沉淀位于做标记的一侧。弃去上清，再在每个管中加1．0ml 70%乙醇（室温下），盖上盖子，混悬振荡3～5s。离心5min，吸弃上清。重复上述操作一次（乙醇）。

以下程序同标准样本的检测程序。

（4）反转录，扩增和检测：在扩增后区—扩增／检测区完成，上机操作。

准备足量试剂：检查加载到COBAS AMPLICOR分析仪上的试剂量，准备足够的试剂以完成预期工作。配制试剂前均需混匀，具体配制如下：将2．5ml IM PS1，v1．5加到一瓶IM4，v1．5中；2．5ml IQ PS1，v1．5加到一瓶IQ4，v1．5中；并将上述配制试剂和IQPS1，v1．5、AD3试剂瓶一起放置到特殊试剂架上。取5ml SB加到一瓶SB3中制备成的底物工作液以及DN4和CN4放到通用试剂架上。在每一个试剂瓶上记录开始使用的日期。

输入试剂信息：按照操作手册用键盘输入或条码扫描来确认试剂架上为通用或特殊试剂，或者使用操作手册AMPLILINK软件完成该操作，输入试剂架上不同位置的试剂及批号。确定每瓶试剂都在正确的位置上并插好在试剂架上。

放置足够的检测杯：检测杯（D cup）架放到检测杯平台上。每个样本和质控需要6个检测杯，并且每一套底物工作液需要两个检测杯作COBAS AMPLICOR的系统空白。

放置A ring放到COBAS AMPLICOR的热循环槽内。输入A ring的编号，操作手册生成一个A-ring工作单。

运行COBAS AMPLICOR开始检测：反转录、扩增、扩增子的稀释和检测由COBASAMPLICOR分析仪自动完成，结果以HIV－1RNA拷贝数／ml的形式给出。

（5）实验质控：质控品结果符合质控要求，实验有效。

阴性质控：HIV－1RNA未检出。

阳性质控：AMPLICOR HIV－1MONITOR低拷贝阳性质控和AMPLICOR HIV－1MONITOR高拷贝阳性质控设定的范围是根据所使用的样本处理程序（标准的或极度敏感的）针对每一批的质控，在COBAS AMPLICOR HIV－1MONITOR Test，v1．5数据卡上提供了该数据。数值的范围要在设立A ring的工作单时使用键盘、条码扫描或AMPLILINK软件输入到COBAS AMPLICOR分析仪上。

（6）结果评价：COBAS AMPLICOR分析仪提供了每份样本和质控的A660值和计算得到的拷贝数。

2．NucliSens HIV－1实验（NASBA）

1）原理NucliSens HIV－1实验是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选择性地直接扩增RNA，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。NASBA实验是用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒将HIV的RNA经释放、分离提取高纯度RNA，与人工合成的控制RNA同时扩增，每条RNA目标序列通过DNA中间体（该DNA分子具有T7RNA聚合酶启动基因），在T7RNA聚合酶作用下，复制成RNA。运用电化学发光原理，检测野生型RNA和人工合成的控制RNA扩增产物。最终以合成RNA的测定结果绘制标准曲线，从而计算出原来的野生型RNA拷贝数。它具有高度的敏感性和广阔的动态范围。

近年，生物梅里埃公司还将NASBA核酸扩增技术与实时（real－time）检测技术结合起来，能够对检测进行实时监控，即称为“EasyQ”。其是利用“NASBA RNA”扩增技术和“分子灯塔探针”技术完美结合，运用即时扩增，荧光光学实时检测野生型RNA和人工合成的控制RNA的扩增产物。最终以合成RNA的测定结果绘制标准曲线，从而计算出原来的野生型RNA的拷贝数。结果表达方式也由每毫升标本的拷贝数（拷贝／ml）改变为每毫升国际单位（IU／ml）。

2）基本检测程序

（1）分离纯化病毒颗粒：根据实验敏感度的要求选择使用0．9ml lysis buffer管或9mllysis buffer管，离心（避免管盖上的液体残留），然后分别加入10～200μl和200～2000μl的血清或血浆，旋转混匀和颠倒混匀，10000g离心30s。随后用220μl溶解缓冲液溶解含Qa、Qb、Qc的标准液，立即旋转混匀（vortex），然后吸取20μl加入上述lysis buffer管中，混匀，离心30s后，每管中加入混匀的silica 50μl，室温（15～30℃）放置10min，每间隔2min混匀一次。再离心30s后，吸取上清。

从固相上洗脱核酸：先每管加入1ml GuSCN，混旋、离心、弃上清步骤洗涤2次；再每管加入1ml 70%乙醇溶液洗涤2次。最后再用1ml丙酮溶液洗脱1次。随后烘干：打开盖子，放置于（56±0．5）℃干式孵育器，孵育10min。

溶解RNA：每管中加入溶解缓冲液50μl，盖上盖子，vortex，继续于56℃±0．5℃干式孵育器中孵育10min，每隔5min vortex一次。旋即用10000g离心2min，小心吸取5μl上清至一干净试管。

（2）扩增

制备引物溶液：加入120μl引物稀释液（primer diluent）（蓝色）到冻干的引物试管（蓝色）。在加入引物稀释液后立即旋振试管直至清亮。不要离心（注意：准备好的引物溶液应在1h内使用）。

引物展开：在每个试管（包含有5μl的纯化核酸）内，加入10μl的引物溶液。关闭试管盖子。放置65℃±1℃干式孵育器孵育5min±1min。

冷却至酶的工作温度：放置41℃±0．5℃干式孵育器孵育5min。

配制酶溶液：加入45μl酶稀释液（红色）到冻干的酶试管（红色）。静止15min，每间隔5min用手指轻轻旋转，以确保完全溶解（注意：准备好的酶溶液在1h内使用，不要旋振）。

预扩增：在每个试管内各加入5μl的酶溶液，轻弹试管，混匀。立即放置回41℃±0．5℃干式孵育器孵育至少5min。

扩增：传送试管到检测实验区域。离心试管（10000g，30s）（使液体集中到试管底部）。使用41℃±0．5℃水浴孵育器孵育90min±5min。取出5μl扩增产物进行检测实验。

（3）检测：配制杂交溶液1～4（分别用于WT、Qa、Qb、Qc的杂交）。杂交溶液1∶选振磁珠溶液（Bead Oligo）（淡紫色）直至形成悬浊均匀的溶液。旋振后立即加130μl磁珠溶液到一个新的试管。另外再加130μl磁珠溶液到WT探针管（白色）。准备杂交溶液2～4的步骤与准备杂交溶液1的步骤一样，只不过将WT探针分别改为Qa探针（红色）、Qb探针（黄色）、Qc探针（蓝色）。在使用前旋振杂交溶液。

对于每个扩增的样品要准备4个5ml的聚丙烯试管（分别对应于杂交溶液1～4）。准备1个5ml的聚丙烯试管，作为空白（用于加入检测稀释液）。

旋振杂交溶液直至形成悬浊均匀的溶液。

加入20μl的杂交溶液1到每个杂交试管1和空白试管。可以重复使用移液器尖。

加入20μl的杂交溶液2到每个杂交试管2。可以重复使用移液器尖。

加入20μl的杂交溶液3到每个杂交试管3。可以重复使用移液器尖。

加入20μl的杂交溶液4到每个杂交试管4。可以重复使用移液器尖。

稀释扩增样品：对于每个扩增样品加入所指定量的检测稀释液（detection diluent）到一个新的试管中，可以重复使用移液器尖。随后加入5μl的扩增样品，关闭试管盖，旋振，离心试管。

对于每个稀释后的扩增样品取5μl加入到4个杂交试管中，空白试管中加入5μl的检测稀释液，分别使用新的移液器尖，封管，混匀。

在41℃±0．5℃的孵育器放置30min±2min，孵育所有杂交试管和空白试管进行杂交（杂交过程中，每间隔10min混匀杂交试管和空白试管一次）。

检测：加300μl的实验缓冲液（assay buffer）到每个杂交试管和空白试管中，可以重复实验移液器尖（此时可以通过试管内的颜色来区分：WT＝无色；Qa＝淡蓝色；Qb＝中度蓝色；Qc＝深蓝色）。

（4）上机检测：按照NucliSens Reader操作手册进行仪器的保养程序。将检测管放入相应反应盘上的位置。在一个5ml的新聚丙烯试管中加入250μl已旋振均匀的仪器参比溶液（reference solution）。按顺序放置试管：仪器参比溶液的聚丙烯试管、空白试管、杂交试管（按照每个样品的顺序WT、Qa、Qb、Qc）等。

运行工作表（参考NucliSens Reader操作规程）。注意：每个批号的试剂盒有一些特定的参数（v参数，标准液Qa、Qb、Qc的水分子总量）。这些参数标示在检测试剂盒上。在运行实验时，这些参数必须输入到NucliSens Reader软件的样品参数窗口中。

（5）实验结果：NucliSens Reader仪器自动地计算加入到裂解缓冲液中血浆或血清的WT HIV－1RNA的拷贝数（copies／ml）。3个标准液信号（Qa、Qb、Qc被纠正背景干扰和对照一系列参数（检测上限、规定最小值、上／下Q水平、其他）检查。3个标准液（或2个保留的标准液，当检查结果时去除Qc时）生成一条标准曲线，依据此曲线计算WT的浓度。

3．HIV－1Quantiplex（bDNA）实验

1）原理　bDNA是分支DNA杂交实验。血浆HIV－1RNA通过逐级放大的信号定量。其原理是通过将捕捉到的病毒基因信号扩增直接检测RNA，即从HIV中提取分离RNA，与靶探针杂交捕获RNA，再通过另一部分靶探针使DNA与RNA结合，信号被逐级放大而靶RNA并没有复制。利用化学发光原理进行信号扩增，发光强度与结合的核酸量成正比，通过同一板上反应的外标曲线计算HIV－1RNA的绝对量，即病毒载量。

2）基本检测程序　见表10-2

表10-2　检测样品数与相应试剂配制

（1）准备病毒颗粒：将离心机冷却至2～8℃，并启动生物安全柜。每1．5ml的离心管内分别加入50μl磁珠混悬液，然后加1．0ml的样品和对照品，标准品和质控品于相应的离心管内，置于冰上或2～8℃待用。迅速将未用完的样品存放于－80～－60℃内。离心1h（2～8℃，23　500g）。离心完毕，吸弃上清，仅留约20μl的颗粒，随后立即在－80～－60℃的条件下，冰冻颗粒至少30min。

（2）调试Q340测试系统：在Main Menu窗口中选择Test，测试项目中选择HIV3．0，并选中Automated模式。

（3）细胞溶解小丸：打开干燥加热培养板，确保温度在63℃。将lysis稀释液放置于37℃水浴箱10～20min，将lysis液、捕获探针、目标探针放置于室温。在50ml塑料管内配制lysis工作液。加盖，颠倒混匀10次，旋涡5s，再颠倒混匀10次，置于室温待用。在每管内加入120μl lysis工作液，盖紧旋涡5～10s。将试管放置于63℃的加热培养板上2h。期间在电脑窗口New ID List中，输入样品代号。

（4）捕获探针和目标探针的连接：从加热板上取出试管，在室温中冷却试管10min。从每个样品试管中移取100μl放置于正确的微孔位。将测试的微孔条放于板盘上，用黑色微孔条填补空缺，在板盘上放置密封薄膜，关上测试系统门并按Start键。培养16～18h（过夜）。

（5）使预扩增物和扩增探针连接：在洗液A和洗液B瓶中加入足够量的液体。将预扩增物／扩增稀释液、低分子右旋糖酐盐、标记物稀释液放置37℃水浴至少10min，颠倒直至彻底混匀，分别配制预扩增物／预扩增工作稀释液和配制预扩增工作液盖紧，颠倒混匀10次，旋涡20s，反复直至彻底混匀，放置37℃水浴，直至气泡消失。当过夜培养完成后，在系统上按Start键开始冷却／清洗板盘的步骤。一般冷却15min后，开门，用多道移液枪加预扩增工作液100μl至各微孔，从A～H。然后关门，按Start键，培养30min，接着冷却／清洗。在此期间，配制扩增工作液，盖紧，颠倒混匀10次，旋涡5～20s，反复直至彻底混匀，放置37℃水浴，直至气泡消失。培养时间一到，即开门，用多道移液枪加扩增工作液100μl至各微孔，从A～H。然后关门，按Start键，培养需30min。接着冷却／清洗。

（6）连接上标记物探针：在仪器冷却／清洗期间，在15ml的塑料管内配制标记物工作液，盖紧，颠倒混匀10次，放置室温直至气泡消失。培养完毕即开门，用多道移液枪加标记物工作液100μl至各微孔，从A～H。然后关门，按Start键，培养需45min。接着冷却／清洗。

（7）信号的输出：仪器冷却／清洗期间，在15ml的塑料管内配制底物工作液，盖紧，颠倒混匀10次，放置室温待用。45min培养完毕以后，旋即开门，用多道移液枪加底物工作液80μl至各微孔，从A～H。然后关门，按Start键，培养需30min。

（8）数据分析：在培养底物期间，准备Bayer数据测量软件（DMS）从系统接收数据。

每次检测必须将质控样品、标准品与标本一起操作完成。判断实验成立必须同时符合：HIV－1阳性对照必须包括在特殊曲线上；以及标准品A平均荧光单位＞标准品B荧光单位＞标准品C荧光单位＞标准品D荧光单位＞标准品E平均荧光单位＞标准品F荧光单位，并且具相关性；阴性对照＜50拷贝／ml。

（9）结果判断：根据标准品的检测结果绘制标准曲线。根据标准曲线计算出结果：如果标本检测拷贝数≥50拷贝／ml，可作定量报告；如果标本检测拷贝数＞500000拷贝／ml，已超过系统检测上限，须将标本稀释后重新检测。此方法的检测灵敏度为50拷贝／ml。

三、免疫细胞检测

用于CD4＋、CD8＋T细胞数的检测方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法主要是指使用流式细胞仪（主要有多平台三级程序法和单平台一步法）和专门的细胞计数仪。手工操作法包括几种手工操作试验，需要显微镜或酶联免疫设备（如ELISPOT等）。目前临床通常使用的是流式细胞仪。流式细胞仪是以流式细胞术为基础发展起来的计数和分析细胞的设备，主要仪器有BD公司的FACSCalibur和库尔特公司的ESP。流式细胞术是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的现代细胞分析技术。目前，应用流式细胞仪测定全血中的CD4＋T细胞亚群有两种方法：一种为多平台法，此方法操作复杂，费时，随机误差大；另一种为单平台法，较为简便、实用、省时和准确。但流式细胞仪不是简单的全自动仪器，需要操作人员具有较高的仪器操作技术水平和较全面的知识背景。从细胞荧光技术上分直接免疫荧光标记法和间接免疫荧光标记法，其中直接免疫荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。间接免疫荧光标记法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果，所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

现介绍临床常用的单平台直接荧光标记法（单平台一步法）检测CD4＋、CD8＋T细胞数。

（一）原理

将单克隆抗体分别结合到淋巴细胞的表面特异性抗原上，同时该单克隆抗体又分别标记了FITC、PE、PeCY5、APC荧光，通过孵育后再裂解全血中的红细胞，然后通过流式细胞仪分析，得到淋巴细胞计数结果。

（二）基本检测程序

（1）室温平衡：在开始实验之前，将仪器校准品、质控品、标本、试剂放置室温（18～ 25℃），实验应在室温下进行。

（2）仪器校准：开机，制备仪器校准品，运行FACSCOMP软件校准仪器。

（3）按照实验质控品及标本所需的数量在试管架上准备绝对计数管，并作好编号等标记。

（4）荧光抗体标记：混匀质控品、标本和试剂，在每一管中加入20μl标记有荧光素抗体的试剂和50μl质控品或标本（EDTA抗凝全血），振荡摇匀。

（5）避光18～25℃孵育15min。(www.daowen.com)

（6）在每一管中加入450～500μl红细胞裂解液（免洗溶血素），振荡器混匀。

（7）避光18～25℃孵育10min。

（8）通过流式细胞仪检测分析：先运行质控品，符合质控要求后再检测标本。

（9）核查质控品及标本编号和试剂信息（批号、有效期、参考微球数等），打印结果。

四、P24抗原检测

P24抗原检测可用于血清或血浆标本抗原检测和细胞培养上清抗原检测。目前常用的P24抗原检测方法为ELISA夹心法，检测结果为阴性的样本，只表示在本实验中无反应，不能排除HIV－1感染；检测呈阳性反应的样本必须经过中和试验确认，若样本的OD值较中和前减少50%以上，才能确定该样本为P24抗原阳性。

（一）原理

将单克隆核心抗体（P24抗体）包被到固相载体上，标本中的HIV抗原与包被的HIV核心抗体结合形成复合物，利用抗体的多价性，酶标记的同类HIV抗原与已形成的复合物结合，形成一个HIV抗原抗体酶标记的HIV抗原复合物，最后加入底物。在酶作用下，产生显色反应，测定光密度值，与标准进行比较。以判定标本的结果。

（二）基本检测程序

1．加液　每孔中加入25μl裂解液，再加入对照或标本100μl，混匀。

1）血清或血浆标本　每块板中，对照应包含3个阴性对照（NC）和1个阳性对照（PC）。

2）细胞培养上清液　每块板中，对照应包含3个阴性对照、1个阳性对照和3个细胞培养上清液对照。

2．孵育　37℃孵育60min。

3．洗板　用磷酸缓冲液洗涤4次。

4．酶标记物结合　每孔中加入100μl酶结合物；37℃孵育60min。

5．洗板　用磷酸缓冲液洗涤4次。

6．底物显色　每孔中加入100μl底物；室温中放30min。

7．终止反应　每孔中加入1mol硫酸100μl。

8．测定　用450nm单波长光或450nm和620～700nm（作为参比波长）双波长酶标仪测定光密度。

9．结果判定

1）实验的有效性　阴性对照值（NC）、细胞培养上清值（CCS）、阳性对照值（PC）均须在下述范围之内。

（1）NC必须在0．000～0．090（双波长）或0．040～0．130（单波长），剔除不在上述范围内的值，计算阴性平均值（NCx），随后再次判定NC的有效性，NC必须在0．5×NCx～1．5×NCx（双波长）或0．8×NCx～1．2×NCx（单波长）范围内。

（2）CCS必须在0．000～0．090（双波长）或0．040～0．130（单波长），剔除不在上述范围内的值，计算细胞培养上清平均值（CCSx），随后再次判定CCS的有效性，CCS必须0．5×NCx～1．5×NCx（双波长）或0．8×NCx～1．2×NCx（单波长）范围内。

（3）PC必须≥0．960（双波长）或≥1．000（单波长）；如果是单一定量（80pg／ml）的，则PC≥0．660（双波长）或≥0．700（单波长）。

2）临界值（cutoff value）计算　NCx＋0．07（血清或血浆）或CCSx＋0．07（细胞培养上清液）。

3）结果解释

（1）阴性：实验检测值（OD）＜临界值。

（2）阳性反应：实验检测值≥临界值。

（3）阳性反应标本应重复双孔试验，如果为阴性，应视为抗原阴性；双孔重复试验阳性标本应做确认试验（中和试验）。若中和试验的阳性反应样本的OD值较之反应前减少50%以上，才可确定为HIV－1P24抗原阳性。

质量控制是指艾滋病检测实验室为了不断提高艾滋病检测工作质量，最大限度地防止误检和漏检，保证我国各级各类艾滋病检测实验室检测结果的正确性和准确性，更好地发挥HIV检测在艾滋病防治工作中的作用而建立的质量管理体系重要环节之一。

建立运行良好的质量管理体系是保证高质量艾滋病检测实验室工作的重要因素，它主要内容包括实验室检测的质量保证（qualityassurance，QA）、质量控制（qualitycontrol，QC）和质量评价（externalqualityassessment，EQA）。质量控制是质量管理的核心，质量控制包括室内质量控制（IRC）和室间质量评价。在全面质量管理体系中，实验室内质量控制是一个重要的环节，是保证高质量操作必不可少的措施；室间质量评价又是使全面质量保证体系标准化、法制化的一条途径；实验室内质量控制是室间质量评价的基础；为了保证HIV检测的准确性和结果的可靠性，各级各类艾滋病检测实验室均需建立完善的规范化的实验室质量管理系统，保障HIV检测全过程的质量控制。本章主要讨论HIV检测的室内质量控制。

一、仪器设备的质量控制

HIV检测主要使用的仪器设备有：酶标仪、洗板机、病毒载量分析仪、PCR仪、电泳仪、超低温高速离心机、普通离心机、全自动免疫印迹仪、移液器、温度计、孵箱、冰箱、超低温冰箱、生物安全柜、流式细胞仪等。为了保证仪器设备的正常运行，出具数据结果可靠，必须建立仪器的维护保养和校准制度，计量仪器还必须有自校和期间核查制度，有些强检的仪器如酶标仪，必须有第3方具备计量器具校验资质的单位完成校验，并出具相应的校验报告。必要时，还需要厂家进行定期的维护和保养。对不属于当时计量单位校验的器具，应要求厂家进行定期维护和保养。

二、样品的质量控制

HIV检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品，目前临床极少采用。

标本的采集要严格按照检测项目的样品要求采取不同的采集方式，尤其是采集抗凝血，必须根据实验要求选择合适的抗凝剂，如CD4＋／CD8＋T细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV分离、核酸定性／定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。采样时，还需注意核对被检者姓名、编号等，避免搞错。

必须按照实验要求，及时处理采集的样品，否则将会影响检测结果。如抗凝全血采集以后，应立即反复颠倒混匀，让血液与抗凝剂充分接触，防止凝块发生；用于核酸检测的样品应在采集抗凝全血以后4～8h内分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆，否则应在24～48h内分离血浆和血细胞。

用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于－20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2～8℃。用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于－20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于－80℃。用于CD4＋／CD8＋T细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。

样品的运送应严格按照生物安全和国际航空运输协会的要求，应采用世界卫生组织提出的3层包装，包装要符合防渗漏、耐受性好、易消毒等要求。

三、检测的质量控制

质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。

质量控制是实施实验室质量保证的一部分，目的是使实验室测定结果趋于稳定，它保障每一步操作产生可信的结果。质量控制包括室内质量控制和室间质量评价，室内质控控制着试验的重复性、精密度。室间质量评价是检验实验室对未知样品获得正确结果的能力，评价实验室检测结果的准确性，室间质量评价能使实验室的质量控制体系更趋完善。完整的质量控制体系，保证了检测结果的可靠性。室内质量控制具体内容是指将控制品（内部对照或外部对照）和检测标本一起实验操作，从控制值的结果了解分析检测过程的质量情况，本次试验是否有效，结果是否可靠。为了便于观测和概括，又使用了一些统计学方法进行归纳和分析。

（一）HIV抗体检测的质量控制

一般使用内部对照质控血清和外部对照质控血清来进行室内质量控制。实验中的内部对照质控血清和外部对照质控血清的平均光密度值以及临界值可以监测批间操作的重复性。目前在HIV抗体检测的室内质量控制实验中所使用的外部对照质控血清为设置在临界值附近的弱阳性对照，如果弱阳性对照在临界值附近出现波动，提示本次实验中有可能对光密度值（OD值或A值，下称OD值）在临界值附近的未知标本作出错误的阳性或者阴性的判断。若弱阳性对照向负值偏移，可能导致出现一些假阴性，反之则可能出现假阳性。这是在HIV抗体检测中必须重视的现象。

1．内部对照质控血清　内部对照质控血清是指每个试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照血清。内部对照对每一次实验的质量控制措施是必要的，是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且内部对照只能在该批号生产的试剂盒中使用。

2．外部对照质控血清　外部对照质控血清是各级实验室为了监控每次检测的重复性和稳定性以及检验试剂盒批间差异而设置的一套对照血清，包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。目前HIV检测实验室常用的是设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值的2～3倍为宜。外部对照质控血清可以从专门生产标准品的公司购买，也可以自行制备（详见附件《全国艾滋病检测技术规范》）。

3．室内质量控制

1）开展质量控制的基础　实施质量管理，建立规范化的质量体系，编制质量手册、程序文件和标准操作程序是开展质量控制工作最基本的保证。从样品收集到报告发出，每一步都严格按照本实验室制订的标准操作程序，可以保证试验的每一步骤均处于控制状态。唯有检验的各个环节和变化因素均处于受控状态，一旦发现失控，就能分析出产生变异的可能影响因素。

2）室内质量控制图的建立和分析　最常用的质控图是Levey Jennings质控图，使用累计和技术或趋势分析技术的图形可提供系统偏移和漂移的状况。

外部对照质控品的平均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控品重复测定的基础上。HIV抗体检测以ELISA为主，以光密度值与临界值的商（S／CO）为统计值。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据，计算平均值（x）和标准差（s），定出控制限。以x±2s为警告限（2s），以x±3s为失控限（3s），做成质控框架图。以后每次随待检样品测定的外部对照质控品的测定值，点入质控图。分析质控图中每次检测质控品值是否在控制限范围内，或者使用一些质控规则，可提示本次实验是否处于告警、失控、位移和趋势状态，从而判定本次检测结果是否有效。

质控规则的使用应检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低的假失控概率。考察试验系统的可靠性应采用多标准质控方案，多规则质控方法能提高误差检出，并具有低的假失控概率。目前HIV抗体ELISA检测中，常用：出现一次2s范围的变化时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。出现一次3s范围的变化，连续2次出现同一方向2s范围的变化，连续4次出现同一方向的1s范围的变化，连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧，则应暂停检测查找原因。

实验室不仅要建立质控图，更重要的是要通过分析质控图，发现产生失控的原因，找出解除故障的方法，并消除原因，防止将来出现同样的问题。所以实验室有必要在建立质控图的同时，应建立分析质控图及失控情况处理程序。

3）“即刻法”质控　“即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。由于更换试剂批号，则应重新建立质控图。有些实验室检测量较少，在未收集到20次质控品的检测值时，已需更换试剂批号，那么这些实验室可以采用“即刻法”质控。

（二）核酸检测的质量

PCR室内质量控制的核心问题就是要避免交叉污染。相比其他检测技术，PCR对实验室及实验操作人员的要求更高，稍不注意，就会因为交叉污染而使PCR的测定结果出现假阳性。

1．实验室管理

1）严格3区划分　较之于其他检测，PCR实验室不仅要求操作人员必须经过专门的技术培训，而且PCR实验室需要特殊的设置。因一个完整的PCR实验过程包括标本制备、PCR扩增和扩增产物分析检测3个步骤，而PCR扩增和扩增产物分析检测中常有大量的特异的DNA存在，是对以后PCR污染的主要来源。因此为保证PCR检测的质量，避免交叉污染，上述3步操作应在不同的实验室或一实验室内分隔开的3个不同的区域内进行，而且3个实验室的仪器设备及所用物品包括加样器、吸头、离心管、手套、工作服、实验室记录等不能混合使用。

2）加强实验室的日常清洁　实验室的日常性清洁是避免污染的最基本的措施，PCR实验室人员严格准入。

2．室内控制外来源核酸污染的几个方法

1）紫外线照射法。

2）“巢式引物”（nested primer）的应用。

3）底物取代法（即dUTP取代dTTP）。

应该强调的是2）和3）两种控制外源核酸污染的方法，只能有效控制来自先前扩增DNA出现的污染，而不能控制在原始标本收集、核酸提取及扩增等由于操作不当而出现的污染。

3．在PCR实验中设置阴、阳性对照　在PCR试验中设置阴性对照的目的在于监测PCR整个过程中可能出现的污染，因此应对PCR的每一个阶段都设置适当的阴性对照。设置的阳性对照也是监测PCR监测质量的有机组成部分，它们不仅可以监测PCR扩增的有效性，还可监测待测标本核酸提取过程中核酸的损失情况。

4．PCR结果的判读　如果PCR实验中的靶DNA序列出现变异，则很有可能出现弱阳性或阴性的结果。因此，对PCR实验结果的判读不准确或者缺乏统一的标准，易于出现假阳性结果，也可出现假阴性的结果。HIV基因组具高度变异性。因此，用于HIV核酸检测的PCR通常使用包括病毒基因组不同区域的多对引物，以避免出现假阴性结果。

5．病毒载量的室内质量控制　除了一般核酸检测的质量控制手段以外，作为一项定量检测的项目，也需使用外部对照质控品，建立质控图，并建立实施分析以及失控的处理程序。但其质控图的参数可以病毒载量值的对数值作为统计参数。

（三）免疫细胞检测的质量控制

1）加强仪器的维护与保养。每次实验完毕，必须严格完成清洗程序。建立并严格实施维护保养制度。

2）加强操作人员的技术培训，尤其是流式细胞仪的操作培训。流式细胞仪不是一台简单全自动的仪器，它需要操作人员具有较高的仪器操作技术水平和较全面的知识背景。

3）每次实验，需先用商业化的标准物质（荧光微球）校准仪器，质控品通过测试后方可检测样品。

4）严格按照标准操作程序采集、处理、检测样品和上机分析。

5）使用商用质控品或中国疾病预防控制中心提供的质控品，建立质控图。在CD4＋T细胞检测中，使用质控图的目的是检查每次实验的质量，发现并及时改正不良操作，同时帮助分析和判断仪器的准备和分析是否均已处于最佳状态。

6）可靠性分析。

（1）CD3＋CD4＋%与CD3＋CD8＋%总和等于CD3＋%±5%。

（2）两管都有CD3的三色试剂检测CD3＋CD4＋与CD3＋CD8＋T细胞时，CD3两管之间的差异≤2%。

（四）室间质量评价

室间质量评价是质量控制的一个基本部分，由独立的组织机构进行。该机构定期地向参加室间质评的各实验室寄送已知经编号的标本，实验室应用其日常方法检测这些标本后，将结果汇报给上述组织结构，于是，该机构在进行适当的统计学分析后，再将各实验室的成绩通知各参加实验室，如果某实验室成绩不佳，则向其提供切实可行的建议和帮助。

室间质量评价能帮助参加室间质量评价活动的实验室发现其在内部质控过程中未被发现的问题，尽可能消除系统误差，不断完善实验室的质量控制体系，所以各级各类艾滋病检测实验室都应积极参加国际、国内权威机构组织的室间质量评价活动或能力验证（PT）活动。

随着艾滋病检测实验室的建设已进入全面快速发展阶段，为加强质量控制，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室已开展了HIV血清学、CD4＋T细胞、病毒载量测定、HIV基因型检测等能力验证活动，各省级确证中心实验室也组织辖区内的艾滋病检测实验室开展室间质量评价活动；为了与国际接轨，不仅参比实验室参加了许多国际权威机构组织的能力验证活动，许多艾滋病检测实验室也纷纷参加国际能力验证活动。此项活动的全面开展，将大大提高我国的艾滋病检测水平，并为参加国际、国内项目的合作提供积极的技术支持。

（五）室内质控的室间评价

室内质控的室间质量评价是将所有使用同一室内质控品同一方法学的实验室质控品检测值数据汇总，获得汇总的室内质控均值、标准差和变异系数均值，然后将本实验室的数据与汇总的数据进行比较，或者比较两组数据绘制的质控图。此种质控方式将室内质控与室间质量评价有机地结合，使质量控制手段更趋科学与完善。目前这种方式的质量评价还处于探讨阶段，有待于进一步完善。

耐药病毒株的产生是抗病毒治疗失败的主要原因之一。如果病毒对几类药物耐药，就限制了许多不同的抗病毒治疗方案的选用，从而也影响了以后的对病毒抑制有效的药物的作用。许多发达国家HIV／AIDS病人使用抗病毒治疗后已经发生了HIV耐药，HIV耐药株的迅速产生是由于HIV高度周转时间（大约每天产生1亿个新病毒）和反转录酶极其高的错误率所致。这将导致高度突变率和持续产生新病毒株，即使在合适的HAART方案治疗和最适治疗依从性的情况下也会产生不同程度的HIV耐药。然而在抗病毒药物的存在下，耐药株便选择性的成为优势毒株。

一、HIV耐药病毒的流行和传播

（一）与耐药流行病学有关的主要术语定义

1．原发耐药或传播性耐药　在未经治疗的病人中所发生的耐药。

由于在没有药物暴露的情况下难以发生的耐药，原发耐药意指具有耐药突变的病毒或直接传播或经一个或多个媒介从一个已获得耐药株病人传播至另一个人。先前未经治疗病人包括由实验室证实新近感染的未服药病人（即根据特殊的实验确定在6个月前至18个月之间），未确定感染时期的新诊断感染者，和未确定感染时期的先前诊断的感染者。原发HIV－1感染应该区别于原发耐药。前者所指的“原发”是用来叙述近期已被感染的病人，后者所指的“原发”是用来叙述感染了传播性耐药的病人。

2．获得性或继发性耐药　在已经接受抗病毒治疗病人中形成的耐药。获得性耐药是由于病毒在病人体内产生遗传变异和随之在治疗时期发生耐药株选择的结果。

3．突变　由于HIV－1高度变异，而没有标准的野生型病毒株。因此在耐药研究中，突变被定义为不同于一个野生型参考序列的氨基酸。最常使用的参考序列是实验室适应病毒株HXB2和NL43以及由在野生型B基因亚型病毒各个位置上最常见氨基酸所组成的一个同源参考序列。这些序列几乎相同，仅有几个氨基酸的不同与耐药无关。使用B基因亚型序列作为参考序列是基于历史先例。

4．多形态　多形态是病毒未暴露选择性药物压力而经常发生的突变。未经治疗是不会发生非多形态性突变的。非频率阈值已被提议用来区别多形态和非多形态位置。

5．电泳性混合碱基　在一条双脱氧核苷序列中的同一位置上出现一个以上的碱基峰表示存在能够被测序方法检出以足够大比例（＞10%～20%）的在相同位置上有不同核苷酸的两群病毒。

6．回复性突变　主要指核苷反转录酶抑制剂（NRTI）耐药突变，如T215回复突变。T215Y／F由于获得两个核苷突变：ACT／C（T）→TAT／C（Y）或TTT／C（F）进化而来。原发感染含有T215Y／F病毒株发热病人常在这个位置发展成为有部分回复突变的病毒。T215C／ D是由于TAT／C（Y）回复突变至TGT／C（C）或GAT／C（D）的结果。T215I／V是由于TTT／C（F）回复突变至ATT／C（I）或GTT／C（V）的结果。T215S（TCT／C）可能是由于或TAT／C（Y）或TTT／C（F）回复突变的结果。T215E（GAA／G）需要来自T215Y（TAT／C）的两次变化而形成或来自普通回复突变T215D（GAT／C）的一次变化而形成。尽管大多数回复突变不降低核苷类抑制剂的敏感性，但是它们一直与对一种新治疗方案增加病毒学失败的危险有关。T215回复突变也是在以前非治疗病人感染的病毒中所观测到的最常见突变，大约在这些病人中发生3%。

（二）HIV－1耐药株的流行和传播

自从1990年末以来，HIV－1耐药株的传播经历了3次不同的浪潮（图10-1）。在2000年前的第1次浪潮中，HIV－1耐药性毒株传播率达15%～20%，主要以NRTI相关突变的病毒为主，特别是由于过去广泛使用了齐多夫定、司坦夫定或拉米夫定（经常连续使用单药或两种药物联合治疗）而产生了胸腺嘧啶核苷类似物突变株病毒（TAM）和M184V突变株病毒。从2000～2005年，HIV－1对非核苷类反转录酶抑制剂（NNRI）的耐药迅速增加，目前已在许多地区和国家成为主要流行的HIV－1耐药性毒株，这是由于广泛使用了依非韦伦和（或）奈韦拉平的结果。然而自2005年以来，已经发生了HIV－1耐多药（MDR）毒株传播的第3次浪潮并引起广泛的重视。2005年所报道发生在纽约市的一个高毒力耐多药感染病例便是最好的例子。由于抗病毒治疗的结果，大多数HIV感染的病人现在得以存活，但是越来越多的病人已经历了使用多个治疗配方的失败。结果，耐药株的传播是有可能发生的。最近来自于旧金山的报告已经强调了这种担忧，因为超过1／4以上MSM承认在过去4个月中未采取保护措施与未感染HIV伴侣发生性关系。

图10-1　HIV-1耐药株的传播趋势：3次耐药突变传播浪潮

HIV-1耐药株的流行早已在不同的国家和地区未治疗病人中以不同程度存在（表10-3）。HIV-1耐药株在美国大城市中的大量男性同性恋者和长期使用抗病毒药物治疗病人中的流行率高达20%以上。在旧金山，1996～2002年，耐药株的流行在急性或新近感染者中为18%～27%。在马德里，从1997～1999年和2002年中，耐药株也以同样高的比例传播。在一项对美国40个城市的多中心评估中，371个未治疗病人中的14%病人所感染的HIV-1

表10-3　国外报道的HIV－1原发耐药株流行情况

至少有一种耐药突变。2003年欧洲的一项研究（CATCH- Study）首次报道和评价了来自于17个欧洲国家的1　600多个新诊断的HIV病人中的耐药结果。1996～2002年，原发耐药突变的流行率为10%。这个数据被欧洲的另外一项研究（Strategy to Control Spread of HIVDrug Resistance，SPREAD）所证实。这项研究主要是监测了2008个新感染者和未经ARV治疗的病人中原发耐药及其与临床的关系。对NRTI耐药从一开始观察到的13%比例下降到以后的6．5%左右，而对NNRTI耐药突变的频率从2．3%增加到9．8%。蛋白酶耐药的频率仍然稳定在3%～4%。1999～2002年，发现在HIV－1B基因亚型病毒中存在12．9%的耐药突变，而在非B基因亚型病毒中仅存在4．8%。然而随着时间的推移，非B基因亚型中的耐药突变逐渐增加（从1996～1998年的2．0%到2001年的8．2%）。一项法国研究首次报道了依非韦伦耐药HIV传播的案例。该研究人员检测了56名在2004年和2005年法国南部HIV－1近期血清学阳转病人。传播性耐药株的总体流行应当率是16．4%。而2名病人（3．6%）感染了对依非韦伦耐药有关的编码gp41基因突变的病毒：一个病毒含有N42D；另一个含有G36D。第1个病人是MSM，从他的伴侣获得了耐多药病毒。值得注意的是第2个病人除了对依非韦伦耐药外，对其他药物不耐药。由于使用标准的测序方法不能检测低于25%比例的劣势病毒群，因此在不同地区的HIV－1耐药株的传播率可能被过低估计。2004～2005年的2年中，由中国疾病预防控制中心、沈阳中国医科大学、军事科学院和上海疾病预防控制中心联合进行的全国31个省市的HIV耐药性专项调查发现我国的HIV－1原发耐药株流行率在3．5%左右。

（三）抗病毒治疗引起的耐药性突变

接受抗病毒治疗病人所产生的耐药率与治疗配方、治疗时间以及药物配方的变换有关。美国1998年对1996年和1997年进入治疗的101　100名病毒载量超过500拷贝／ml的病人进行基因型耐药检测，发现至少对一种药物的基因耐药突变率达到了76%；法国对1997～2002年的7000份进行基因型耐药检测，发现至少对一种NRTI耐药的病人占78．3%，至少对一种NNRTI耐药的病人占38．9%，而PI耐药的比例为47%。另外一项研究发现，即使是刚开始进行抗病毒治疗时间不久（3个月）的乌干达，107名治疗的病人中有63%出现了至少对其中的一类抗病毒药物耐药。接受抗病毒治疗的艾滋病如此高比例耐药株的检出率无疑增加了耐药株的传播风险，并限制了新近感染者的抗病毒治疗效果。同时，还发现了治疗病人中存在高度耐药株的“超级传播者”。我国2003年正式在全国范围内开展了免费抗病毒治疗，截至2005年底已累计治疗近3万人。从2004～2005年的2年中，由中国疾病预防控制中心、沈阳中国医科大学、军事科学院和上海疾病预防控制中心联合进行的全国31个省市的HIV耐药性专项调查，结果表明在3　252个经抗病毒治疗的病人中，发现治疗人群总耐药突变率为17．2%（耐药人数／调查人数），而在病毒抑制失败的人群中，总耐药突变率已达50%以上（耐药人数／病毒抑制失败人数）。我国多项研究表明HIV耐药突变主要是针对NNRI产生的高度耐药，并已经产生了耐多药毒株。

由于反转录酶在HIV－1复制周期中的重要作用，因此是抗病毒治疗的一个重要靶点。至今为止，经美国FDA批准临床使用的21种药物中，有11种药物是反转录酶抑制剂，包括7种NRTI：齐多夫定、司坦夫定、拉米夫定、Didanosine、阿巴卡韦、扎西他滨和Emtricitabine，非环状单磷酸核苷类（替诺福韦）和3种NNRTI：奈韦拉平、依非韦伦和地拉韦定。HIV－1反转录酶基因在反转录酶抑制剂的选择性压力下，通过单个位点或多个位点的突变积累，使HIV－1逃逸反转录酶抑制剂的抑制作用，从而影响了针对反转录酶的长期抗病毒治疗效果。现在已知HIV－1反转录酶基因的61处氨基酸突变与反转录酶抑制剂有关，其中18处氨基酸突变与现在批准使用的7种NRTI以及非环状单磷酸核苷类耐药相关，16处与现在批准使用的3种NNRTI耐药相关。

由于对反转录酶抑制剂的耐药是一种非常复杂的现象，比目前已知更多的突变与耐药的发生有直接关系并因而导致抗病毒治疗失败。国外一些研究已经发现了许多与NRTI和NNRTI抗病毒药物治疗有关的新的耐药突变位点，以及新的耐药位点与目前已知的耐药位点并存的关系，然而它们在NRTI和NNRTI耐药发展中所起的准确作用仍然不很清楚。一项研究已发现多个与NNRTI耐药相关的突变（K101Q、I135M／T、V179I、H221Y、K223E／Q、L228H／R），尤其发现了这些新耐药突变位点与已知耐药位点之间的关系（I135M／T与K103N并存；H221Y／L228H与Y181C并存；K223E／L228R与F227I并存）；另外发现存在新耐药突变位点与耐药性增强有关，如K101Q、I135M和L228H／R与对NVP和EFV耐药增加20倍有关；K223E／Q与EFV耐药增加15倍有关；I135T和V179对NVP耐药增加15倍有关；同时与K103N存在的I135T、I135M、K101Q，对K103N／EFV耐药分别增加3．4、9．5和4．7倍；而H221Y在Y181C／NVP耐药中增加12．4倍。另一项研究发现了多个与NRTI耐药相关突变位点（K43E、K43N、E203D、E203K、H208Y、D218E、K20R、V35M、T39A、K122E、G196E）。这12个突变的频率在经历4种以上NRTI治疗的病毒中显著增高。尤其是K20R、V35M、T39A、K43Q、K43E、K122E、H208Y和D218E与未治疗人群和使用少于3种NRTI的人群比较，其增高的频率具有显著的统计学差异。而这些新的耐药位点（T39A、 K43E、K43N、K43Q、K122E、E203K和H208Y）分别与M41L、L210W和T215Y以及其他NRTI（E44D、V118I、K219N和K219R）有较强的交叉耐药关系；D219E与K219Q、D67N、K70R、L74I和T215F有较强的交叉耐药关系，K20R与上述耐药突变位点和T215F有交叉耐药关系。

在笔者所进行的全国HIV-1耐药性调查中，已经发现在HIV－1B′亚型感染人群中一个新的与治疗相关的突变位点——H221Y和其他新发现的突变位点（K101Q、V179YI、K223E／Q、L228H／R），这些突变在Standford大学HIV－1耐药数据库中还未正式启动对比分析。221位点在未治疗组中高度保守，没有发生氨基酸替换；而在治疗组中此位点出现了氨基酸替换，而且替换率要明显高于未治疗组，分别为11．1%（14／126）和0．0%（0／71），该位点最主要的突变形式H221Y突变（组氨酸突变为酪氨酸）在治疗组中的比例（10．3%，13／126）也显著高于未治疗组。这些新突变位点（H221Y、K101Q、V179YI、K223E／Q、L228H／R）占治疗人群耐药突变的27．6%，并与已知的耐药突变位点同时存在，在我国抗病毒治疗发生耐药的人群中具有较高的比例（全国耐药调查未报道资料）。

二、耐药机制

（一）NRTI

NRTI是一类仅在转换三磷酸后成为有效的前药。核苷类似物仅需要两次磷酸化步骤。磷酸化的NRTI与自然形成的dNTP（脱氧三磷酸核苷）竞争。磷酸化的NRTI掺入至前病毒DNA中可阻止前病毒DNA进一步延长和中断DNA链。有两种主要的生物化学机制引起NRTI产生耐药。由突变引起的空间位阻抑制使反转录酶能够识别NRTI与dNTP之间的结构差异而防止NRTI的掺入和有利于dNTP的掺入（例如在突变M184V、Q151M、L74V或K65R的存在下）。通过ATP的磷酸分解或焦磷酸酸酯化导致剪切早已掺入在DNA链中的NRTI。这发生在突变后如M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q。磷酸分解导致NRTI之间的交叉耐药，而在这些药物之间的耐药程度之间有所不同（齐多夫定，司坦夫定＞阿巴卡韦＞托西他滨，去羟肌苷＞拉米夫定）。与剪切所造成的突变相反，K65R突变与野生型病毒相比，则降低对所有NRTI剪切的能力，导致了较大的稳定性。对K65R突变，一方面它的相反机制的联合作用降低掺入；另一方面降低了剪切，从而导致了降低对绝大多数NRTI的敏感性，但增加对齐多夫定的敏感性。

（二）NNRTI

NNRTI同样抑制病毒的反转录酶。NNRTI是一些结合邻接于反转录酶催化区域的亲水性口袋的分子。在NNRTI结合位点的突变降低NNRTI对反转录酶的亲和性而导致丧失了NNRTI的抗病毒活性和治疗失败。

（三）PI

PI阻碍由蛋白酶裂解病毒前体gal-pol-聚合蛋白，而产生未成熟的、非感染性的病毒颗粒。PI通常发展缓慢，这也称之为遗传屏障。对PI来说，在主要（major）或原发（primary）和次要（minor）或继发（secondary）突变之间存在着差别。主要突变是造成表型突变的原因。这些突变在对一种药物耐药的过程中较早被选择出现，并位于HIV蛋白酶的活化部位中。它们降低了PI结合酶的能力。主要或原发突变也可能导致降低蛋白酶的活性。次要突变（经常被称之为继发突变）位于酶活化部位的外面，通常在主要突变发生后出现。次要突变尤其可被发现在非B基因亚型中以多形态位点出现。次要突变主要补偿由主突变造成的降低病毒的适应性。然而，主要突变与次要突变的区别仅能提供大约耐药程度的估计。

（四）融合酶抑制剂

融合酶抑制剂（FI）不同于担任阻止HIV在感染性细胞中的复制作用的NRTI、NNRTI和PIa，FI而是阻止HIV进入它的靶细胞。当HIV外膜糖蛋白gp120，结合到靶细胞上的CD4受体和趋化因子辅助受体CCR5或CXCR4时，就开始进入细胞的第1步。在跨膜糖蛋白gp41中的2段7肽重复序列区，HR1和HR2之间的相互作用引起了gp41的构象变化，使病毒和细胞膜能够融合，而使HIV进入宿主细胞。PI的依非韦伦（T 20），是一种由36个氨基酸组成的合成肽，模拟gp41C末端HR2区，竞争性地结合HR1。这样，阻滞了HR1和HR2之间的相互作用，抑制了病毒融合宿主细胞必需的gp41构象变化。gp41上的单个氨基酸置换能降低T 20的效果。

三、HIV－1耐药监测和公共卫生意义

监测区域性传播性HIV－1耐药株的流行不仅可为治疗指南提供信息，而且可提供关于HIV－1流行控制成功的反馈信息。监测传播性耐药毒株能够提供信息以支持公共卫生主体在设计教育和预防规划，尽可能将耐药性病毒株繁荣发展和传播降低到最低限度，并由治疗规划、临床医师和决策者支持合理使用抗病毒治疗药物。由于研究设计上的差异和使用不同的耐药突变数据库，在比较国家、地区和地方的传播性耐药毒株的估计数时就颇为困难。

作为流行病学研究，突变应该是引起耐药所公认的、应该在未治疗病人中呈非多形态，应该是适用于所有的基因亚型的突变。另外，数据目录应该简单，不必包括大量的突变尤其是罕见的突变，以避免监测复杂化，并避免降低统一接受的已经广泛使用的标准耐药目录。

加强HIV检测实验室和基本临床实验室的能力以支持治疗应该被重视。HIV耐药检测应该被储备用于监测，可以在一个区域性实验室或一个国际合作实验室中进行。基因分型是HIV耐药监测的首选实验室检测方法。WHO推荐的和我国将要推出有关HIV耐药监测和监控策略如下。

（一）监测类型

1．耐药哨点监测　在一个治疗点（医院／诊所），使用同样的治疗方案从开始治疗到观察期满一年时，仍能保持至少96名治疗对象的点，观察其耐药性的发生和发展情况。

2．耐药“警戒线”监测　在一个或几个艾滋病检测机构有72名以上的新近艾滋病感染者所分布的地区开展耐药性检测，以耐药率＞5%来判断分布地区发生了耐药毒株的传播和流行。

3．回顾性耐药监测　通过整群抽样，在开展抗病毒治疗地区已经接受抗病毒治疗的艾滋病病人和部分未治疗的HIV感染者进行耐药性检测，初步了解该地区耐药毒株发生情况及其影响因素，抗病毒治疗失败者中耐药发生比例，以及了解未接受抗病毒治疗感染者的耐药出现情况。

4．早期预警监测　通过对各地区抗病毒治疗工作的相关指标，如药物库存情况、服药依从性、生存率、治疗失败率等来判断抗病毒治疗发生的危险，抗病毒治疗在降低耐药发生方面是否发挥作用。

（二）检测方法

基因型耐药检测为主，结合表型耐药检测，参考病毒载量和CD4指标。

（三）监测对象

1．耐药哨点监测　从未接受过抗病毒药物治疗的艾滋病感染者，在其接受抗病毒治疗前，以及治疗后的一段时期内进行监控。

2．耐药“警戒线”监测　6个月内新近感染的艾滋病感染者。

3．回顾性耐药性监测　已接受抗病毒治疗的艾滋病病人。

4．早期预警监测　抗病毒治疗的相关信息。

（四）监测指标

1．耐药监测实验室指标

（1）病毒学指标（病毒载量）：抗病毒治疗前后进行病毒载量检测。

（2）耐药性指标：只检测治疗后病毒载量＞1000拷贝／ml的样本。如果样本有耐药性突变，则对该对象治疗前保存的样本进行耐药性检测，以判断在治疗前是否存在耐药。

（3）免疫学指标（CD4细胞）：CD4细胞绝对计数。

2．耐药监测相关指标

（1）流行病学指标以流行病学数据库为主。未建立流行病学数据库的地区，单独收集相应指标。

（2）临床指标以治疗数据库为主。未建立治疗数据库的地区，单独收集相应指标。

四、中国HIV耐药检测／监测网络

（一）中国HIV耐药检测／监测网络组织的建立

于2004年7月，在卫生部和中国疾病预防控制中心的统一部署下，成立了包括实验室、临床、流行病和统计学专家组成的全国HIV耐药工作组，由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒与免疫研究室牵头，联合沈阳中国医科大学艾滋病研究所、军事医学科学院全军艾滋病检测中心和上海市疾病预防控制中心性病艾滋病科组成全国HIV耐药检测核心实验室，并与全国各省市疾病预防控制中心组建成中国HIV耐药检测／监测网络。

（二）中国HIV耐药检测／监测网络的目标

（1）系统收集中国HIV耐药性的发生、变化以及传播信息。

（2）查找影响中国HIV耐药性发生变化及传播的影响因素。

（3）探索减少和控制HIV耐药性的发生和传播的防治策略和方法。（4）为各级卫生决策部门提供HIV耐药性的相关关系。

（三）中国HIV耐药检测／监测网络的总体任务

（1）完善和拓展中国耐药网络。

（2）构建中国HIV耐药数据库。

（3）制订中国HIV耐药监测实施方案。

（4）动态监测中国接受抗病毒治疗的艾滋病病人耐药性出现规律及其影响因素。

（5）动态监测耐药性病毒株的传播。

（6）为合理用药方案提供依据，为抗病毒治疗提供技术保障。

（7）对网络内省级疾病预防控制中心耐药检测实验室人员进行培训。

（8）对网络内省级疾病预防控制中心耐药检测实验室进行质量控制。

（9）与WHO耐药网络及世界其他耐药网络沟通，引进HIV耐药相关技术的传播相关信息。

（10）为全球HIV耐药数据库提供相关数据。

（四）中国HIV耐药检测／监测网络工作计划

1．阶段一（2004～2005年）　在卫生部的统一领导和部署下，以国内4个耐药检测核心实验室为核心，与国内31个省级疾病预防控制中心的艾滋病实验室建立了网络联系；开展了现场监测和实验室检测技术的短期培训；建立了中国HIV耐药性监测初步方案，并在部分省及全国范围内试点实施，完成了4　500人份HIV感染者的耐药检测工作；完成了《中国HIV耐药性监测网络通讯》的首期编辑和发放工作。

2．阶段二（2006～2007年）　结合WHO的全球HIV耐药监测方案，进一步完善中国HIV耐药性监测方案；充分利用国际、国内艾滋病防治资金，考虑不同高危人群和HIV基因亚型的分布特征，在10个省建立15个国家级HIV耐药监控哨点；强化省级以及HIV综合示范区疾病预防控制中心人员耐药性调查和实验室检测技术培训；继续以中国HIV耐药网络为依托，完成6000人份的耐药性检测；初步建立中国HIV耐药性数据库；初步建立中国HIV耐药性检测实验室检测规范；4个HIV耐药检测核心实验室接受WHO和其他国际机构关于HIV耐药性的实验室质量认证。

3．阶段三（2008～2010年）　建立中国HIV耐药性检测／监测指南和规范；建立中国HIV耐药性数据库，并与全球其他HIV数据库实现资源共享；完成对有能力开展耐药性检测的省级疾病预防控制中心实验室的质量认证；成为全球HIV耐药性监测网络的成员，在地区和全球HIV耐药性检测和监测工作中发挥作用。

（五）中国HIV耐药网络工作已经取得的成绩

在卫生部的领导和中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心的主持下及HIV耐药性检测核心实验室与全国耐药网络实验室的参与下，在全国HIV耐药检测网络成立后的3年中，已经成功地完成了第1阶段的工作目标，正在顺利地开展第2阶段的各项任务。耐药检测网络已经完成5000多人份的耐药性检测，已经建立了6个国家级耐药性检测哨点，网络内省级和县级疾病预防控制中心人员有200多人次接受耐药性检测的短期培训，10个省级疾病预防控制中心人员已经完成耐药性检测技术中长期培训。WHO对中国HIV耐药检测工作给予了高度评价，已经派出专家组对4个耐药检测核心实验室进行了初步质量评估，正在进行接纳中国耐药检测核心实验室加入WHO全球耐药监测网络的工作。全国HIV耐药检测网络实验室还受到了美国国立卫生研究院（NIH）的技术支持，并与多个国际机构建立了广泛的合作和交流。4个耐药检测核心实验室已经通过了美国NIH的两次HIV耐药检测质量控制品的考核。

中国的HIV耐药监测是发展中国家抗病毒治疗工作的重要组成部分，其成功的经验不仅推动中国也将推动发展中国家抗病毒治疗的可持续发展。

五、HIV耐药检测技术与方法

（一）耐药检测方法

至今为止已有2种检测HIV特异性抗病毒药物耐药或敏感性的商品化检测试剂，如基因型（genotype）和表型（phenotype）耐药检测方法。这些方法包括HIV－1TrueGene，BayerHealthcare Diagnostics（现被西门子公司收购）；或ViroSeq，Celera Diagnostics／Abbott Laboratories。其他公司和实验室开发的基因型耐药检测试剂正在进行临床试验，如Virco．TYPE HIV－1，Virco，GenoSure（Plus），LabCorp或GeneSeq，Monogram Biosciences（原公司为ViroLogic）。表型试验耐药性检测试剂包括Antivirogram，Virco；PhenoSense，Monogram Biosciences（原公司为ViroLogic），and Phenoscript，Viralliance。表型检测方法的缺点包括检测耗时和费用较高。根据实验室的要求和使用方法，在欧洲基因型检测花费为350～500欧元，在美国为250美元，在中国为200美元（手工方法50美元左右）；而表型检测方法花费2～3倍基因型检测方法。两种方法的缺点同样是需要有一定量的病毒。一般病毒量每毫升低于500～1000拷贝时，检测就会困难。

1．表型分析　病毒基因型的变化决定了病毒表型的特征，进而决定了病毒对化疗药物的耐受情况。传统的表型分析就是首先要在HIV感染者体内分离出病毒，进行病毒培养，然后以外周血单核细胞（PBMC）所产生的HIV壳蛋白（P24抗原）作为50%的抑制浓度（IC50）的定量检测指标，对其进行体外药敏试验。病毒表型分析方法能够直接确定感染者对各抗病毒药物的敏感性以及耐受程度，但整个过程需要6～8周。这种方法不仅操作技术要求高，步骤繁琐，价格较贵，而且无法提供交叉耐药的信息。同时在病毒培养过程中也可能产生耐药性。此方法最大的缺点是无法对体内病毒载量处于较低水平的感染者进行检测。

随着分子生物学技术的发展和应用，两个公司（ViroLogic，San Francisco，CA和Virco，Mechelen，Belgium）首先开发了改良的表型分析方法（基于DNA重组的表型分析），省去了病毒分离步骤，缩短了检测所需要的时间，检测过程可以自动化操作，节约了人力，从而实现了实验的稳定性和可重复性。ViroLogic公司开发的PhenoSense表型检测的原理是应用RTPCR扩增方法，获得了HIV感染者的HIV－1蛋白酶和反转录酶基因，利用重组DNA技术制备一个含有这些重组基因区的病毒载体。该载体含有一段荧光素酶标记的基因替代HIV包膜基因，将感染者的蛋白酶和反转录酶基因与载体进行基因重组形成重组病毒。重组病毒在受试药物的存在下进行复制传代，同时检测荧光素酶的表达量。通过与药物敏感的标准病毒株比较，建立药物浓度的对数曲线图，计算出IC50值。Virco开发的方法是将扩增的蛋白酶和反转录酶基因插入到无该基因的标准HIV株中，转染一个CD4＋细胞系，产生含有感染者蛋白酶和反转录酶基因的重组HIV病毒株。使用高分辨度的光镜对此嵌合细胞系在不同的药物或同一药物的不同浓度梯度下培养进行实时监测，即可直观地测定出重组病毒对不同抗病毒药物的敏感性IC50。

体外表型耐药试验是直接定量检测药物的敏感性。在一种抗病毒药物浓度增加所造成的选择性压力下，于细胞培养中检测病毒的复制能力，并与野生型病毒比较病毒复制能力。药物浓度用IC50值表示。病毒的敏感性指IC50与野生型参考病毒株的IC50之比值，并与临界值相比较。临界值是指在与野生型病毒株IC50比较时，HIV分离病毒株IC50可能增加而同时仍然被认为是敏感的因素。确定临界值在结果解释中是非常重要的。

临界值定义：目前使用3种不同的临界值。技术性临界值是一种测量检测技术方法可变性的数值。生物学临界值是从未经ART治疗HIV感染者／病人中分离的野生型病毒分离株个体之间的可变性。如果IC50低于生物学性临界值，病毒学成功是非常可能的。然而，高于生物学临界值IC50将不能预测对药物的病毒学反应。相反，临床临界值是指到何种水平的IC50能够期望病毒学成功。加强的（boosted）蛋白酶抑制剂的临床临界值高于非加强的蛋白酶抑制剂。但是通过利托那韦的强化，药物水平可以克服某些耐药的水平。VircoType和PhenoSense检测方法的结果报告包括低和高的临床临界值。低临床临界值是IC50中的倍数变化（fold－change），表示一种稍微降低的病毒学反应。倍数变化高于临床临界值表示耐药；倍数变化在两种临界值之间，表示部分耐药。

如果有HIV准种病毒存在，体外表型耐药检测不可能预测临床结果。体外表型耐药检测至少是基因耐药检测花费的3倍，而且仅由为数不多的几个主要实验室使用不同的方法。WHO不推荐使用体外表型检测作为常规监测目的。

2．基因型分析　决定病毒基因特性的核酸序列构成了病毒基因型，基因型耐药性检测HIV基因组中与耐药性相关的基因突变。常用的基因型分析是评价反转录酶和蛋白酶（PR）的氨基酸序列。基因型耐药检测操作较传统的抗病毒药敏试验复杂，但是能够检测出包括点突变在内的微小突变，也能够检测出过度性突变（在表型水平上不影响病毒耐药性的低水平表达突变）。基因型分析既能够为药物选择压力的存在提供依据，也可以预测潜在HIV耐药的出现。在HIV基因组中聚合酶基因这两个区域的核苷酸序列与特定的野生型参考病毒序列比较。描述耐药突变时，应用标准的格式即根据在HIV基因组PR和PR区序列中突变密码子的数字位置。使用相关密码子位置的数字和两个字母：在数字左方的字母代表野生型病毒在该位置密码子的特定氨基酸；在数字右方的字母代表突变密码子所产生的氨基酸。如M41L表示在反转录酶基因上第41氨基酸位置上的密码子发生突变而导致甲硫氨酸置换亮氨酸。

基因型检测是基于分析与耐药相关的突变。可以使用对扩增的HIV基因组直接测序，或与野生型或突变型病毒序列寡核苷酸进行特异性杂交等方法进行分析。基因型检测方法高度敏感，并能在鉴定20%以上所有已知的任何HIV循环准种病毒的耐药毒株。基因型检测与降低大多数HIV药物敏感性有关的突变已经被很好地阐述，但是许多不同的耐药模式（可能也包括补偿性的突变）在确定对有些特定药物耐药程度方面变得困难。解释基因型耐药模式是基于基因与表型之间的关系。已经获得了经体外试验、临床观察和重复试验所得到的数据，而这些相关的耐药位点已经被表型耐药研究所证实。

目前至少有4家公司开发了基因型检测方法：TruGene（Visible Genetic Inc．，Toronto，Canada），ViroSeqHIV－1基因分型（Applied Biosystems，Foster city，CA），GeneChip（Affymetric Inc，Inc．）和LiPa（Innogenetics，Alpharetta，GA）。这些方法的检测步骤都是PCR扩增病毒蛋白酶（99氨基酸）和反转录酶部分片段（250～350氨基酸）。目前国外大多数医院和实验室以及国内小部分医院和实验室使用商品化的直接基因测序和自动分析（TruGene和ViroSeq）方法来评价是否突变以及耐药情况。由于这些商品化的试剂和仪器价格昂贵，在发展中国家的使用受到了限制，因此由实验室自身配制的RT PCR扩增方法（home brew）和测序并使用国际通用的耐药数据库的检测模式由于简便快速和经济等优点已被广泛接受和应用，基本上满足了发展中国家的临床检测和公共卫生监测的用途。

由于所有的突变组合所引起的临床后果信息还不甚了解，因此预测混合突变的临床结果是有困难的。然而，全面理解基因型与表型之间的关系、基因型与临床后果的关系正在不断探索中。

2004年，国际艾滋病协会（IAS）美国专家小组报道了关于在成人HIV感染中的抗病毒耐药试验的文件。该文件和以后更新的资料列出了报道频率最高的与商品化抗反转录病毒药物耐药相关的突变。在2004年11月后，尽管一些研究者会在列表中省略或增加突变信息，但是大多数HIV耐药流行方面的研究遵循IAS USA突变应用指南。另外，在美国斯坦福大学HIV耐药数据库网站中可以获得大量与HIV耐药相关的信息。在该数据库中，输入个体的序列或突变序列可以获得对商品化抗反转录病毒药物是否敏感和耐药的信息和解释。该数据库也列出支持结果解释的文献出处的链接（体外实验研究和临床结果研究）。一些商品化的耐药检测试剂也提供了对耐药突变的解释指南（如TruGene，GeneSeq，Retrogram）。

3．虚拟表型　虚拟表型是一种从基因型结果中进一步预测表型结果的方法，即在大量的基因型和表型比对数据的分析下解释基因型的突变模式。基因型解释系统VircoType和geno2pheno两者都基于一种虚拟表型。对VircoType解释系统来说，与感染病人病毒相匹配的基因型是通过搜寻数据库而被确定的。相匹配的每种病毒IC50结果是平均结果，因此产生了病人病毒的可能表型。在最新版的VircoType中，根据新的多线性回归模式分析，可以鉴定引起特异性耐药的病人病毒的所有突变。由geno2pheno系统执行的机器学习方法（machinelearning approaches）可以预测表型耐药。尽管虚拟表型方法预测耐药有：①定量和客观；②可以整合突变复杂的相互作用；③具有基因型和表型两者的优点；④结果与病毒的实际表型具有很好的相关性；⑤检测时间短（2周）；⑥有表型检测价格低；⑦可独立地预测临床结果等优点，但是由于需要大量标本序列的比对等缺点而受到限制，至今尚未被广泛地应用。

下述网址是免费提供耐药结果和解释的最重要的数据库。

·Stanford Database：http：／／hiv．net／link．php？id＝24

·Los Alamos Database：http：／／hiv．net／link．php？id＝25

·geno2pheno：http：／／hiv．net／link．php？id＝26

·HIV－Genotypic Drug Resistance Interpretation．ANRS AC11：

·http：／／hiv．net／link．php？id＝138

·HIV－GRADE：http：／／www．HIV－grade．de／cms／grade／homepage．html

大多数数据来自于感染HIV－1B基因亚型的病人（仅代表全球HIV－1感染人群的12%），然而，目前HIV－1非B基因亚型也已被研究与耐药之间的关系。耐药的途径和模式在不同的HIV－1基因亚型中可能是不同的。

检测劣势HIV－1耐药株的方法学比较见表10-4。

表10-4　检测劣势HIV-1耐药株的方法学比较

（二）HIV耐药检测的标本类型

1．血浆　血浆（plasma）是用于HIV耐药检测研究和临床目的的常规样本类型。检测目的主要针对病毒载量可能是低的治疗中的病人。在含有抗凝剂的试管中采集全血以避免病毒被血块吸附（血块会在血液采集后不久开始形成）。当由于ARV治疗后病毒载量处于低水平时，不形成吸附HIV的血块会帮助保证足够水平的病毒进行PCR扩增和基因型。如果血浆不被分离和冷冻或者“点”干燥，在血液中的RNA酶持续地降解HIV。由于在高温下降解比较快，尽快进行血浆分离和冷冻或成点是重要的。研究已经指出，成功的血浆病毒序列的扩增取决于几种因素：标本的病毒载量全血离心和分离前的时间、血浆分离后的条件（尤其是有无溶血）、分离至冷冻的时间、冷冻血浆的温度和核酸提取、扩增和基因分型操作前的持续时间。由于甚至一次额外的冻融事件对扩增也是有害的。血浆标本用干冰运输和基因型操作分析时才融化标本是十分重要的。来自于干血斑的病毒扩增的证据十分有限，但是有理由假定快速离心和分离是十分重要的。干血斑可以在常温下运输，但是如果基因型检测或病毒载量检测的时间延迟到2个月以上则血浆应该被冷冻。

2．干血斑　干血斑（dried blood spots，DBS）作为一种用于病毒载量测定的标本已经被广泛地研究，已经有几项研究证实了HIV能够从DBS中提取进行病毒载量的测定。扩增用于基因型检测的大片段基因组序列也已经被报道，但是最近的研究尚未有正式文献报道。几项研究正在由WHO HIV参比实验室进行研究以描绘出促进采用DBS进行基因分型的实验条件（时间、温度和湿度），但是WHO HIV研究网络实验室专家复习了现有的信息并相信这些信息是足以将DBS作为基因分型检测方案的部分。DBS在HIV耐药监测中有很多种优点。DBS可以获取用于其他目的的剩余血液制备。另外，所使用的滤纸易获得和储藏，尽管必须严格按照制备方法制备DBS，但是所需要的培训要比采集血液来得容易。一旦DBS干燥，在血液中的RNA酶几乎停止降解HIV，因此病毒可以在较长的时间内保持稳定。由于不需要冷冻，DBS可以在发展中国家比较容易运输。由于潮湿对DBS的稳定性不利，因此必须装入含有干燥剂的密封袋中。尽管在室温下相当稳定，但短时间保存推荐储藏在4℃，超过1个月以上保存推荐储藏在－20℃的环境中。DBS早已广泛使用在资源有限的国家，作为HIV血清监测哨点和HIV耐药检测的标本类型。在这些国家中，DBS可以按照检测方案被用来进行HIV耐药哨点监测。

（三）HIV基因型序列测定检测法（推荐方法）

1．表型和基因型检测简易流程　见图10-2。

图10-2　表型和基因型检测简易流程

2．RNA提取方法　参照商品化RNA提取试剂说明书操作。

3．扩增引物序列　见表10-5。

表10-5　扩增引物序列

注：标＊者可用于测序用。

4．RT PCR扩增

1）cDNA合成　试剂见表10-6。

表10-6　cDNA合成的试剂

42℃水浴1h。95℃孵育5min灭活反转录酶，放置于冰盒5～10min，恢复至室温。短暂离心以消除管壁上的液滴。得到的cDNA作为套式PCR的模板。

2）套式PCR扩增　见表10-7。

表10-7　套式PCR扩增

建议使用第1轮RT PCR一步法商品化试剂，以减少操作步骤和节省时间。

3）PCR扩增产物鉴定　取5μl PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳中电泳，电泳仪电压设置为100V，40min左右在紫外透射仪上观测结果，并拍照归档。

4）PCR扩增产物纯化　PCR扩增产物纯化按照商品化试剂说明书操作。

5）PCR扩增产物测序　可以自行或送测序公司测序。WHO HIV耐药监测网络实验室专家推荐耐药检测实验室自行进行测序。

5．结果分析和解释

1）序列拼接过程　建议使用Invitrogen公司Vector NTI软件包组件（Contig Expression组件）完成各序列的拼接，可以向Invitrogen公司购买该软件。

（1）打开Cexpress．exe应用程序，进入Contig Express操作界面。

（2）点击菜单上的“Project”，选择“Add Fragments”，选择ABI文件。

（3）选择存放的ABI文件（即测序结果的彩图文件）的目录，选择文件并打开，添加进Contig Express软件。

（4）选中要拼接的序列，再选菜单中的“Assemble”下的“Assemble Selected Fragments”命令，或用工具栏上的按钮。若两个结果能够拼接起来的，会得到一个Assemble 1下的contig 1的结果。

（5）双击contig 1，打开拼接后的结果。此时在两条序列重合处会由绿色竖线标记出两条序列的不同之处，点击绿色竖线可直接找到有误差的地方，可进行修改。

（6）在修改过程中发现有误差的地方，可以根据峰型来判断多读或漏读进行修改，漏读碱基位置由点表示，多读则可以将其删除。

（7）完成全部修改后，所有的绿色竖线就消失。使用在工具栏中的按钮“find next ambiguous”来寻找序列中因两条序列碱基不同而出现的N值，在正链上进行修改。

（8）经过校正和修改后，两条序列的重叠部分已经完全一致，序列已经拼通，可以把整个拼接结果保存下来，可以右击contig 1选取“Select All”，再选“Copy sequence from…bp to…bp”，然后打开可存放文本的应用程序如记事本，将整个序列粘贴进去保存即可。

2）美国斯坦福大学HIV耐药数据库使用程序

（1）进入Stanford HIV－Drug Resistance Database（http：／／hivdb．stanford．edu），点击HIV－PROGRAM，进入下一界面。

（2）点击Analyze sequence，进入下一界面。

（3）点击标题下的浏览框选择所要分析的序列所在文件夹，或者将编辑好的序列（文本格式）粘贴到此界面上方的Text Input里，点击Analyze，进入下一界面。

（4）Sequence Quality Assessment：此表对所测得序列PR基因包含1～99个密码子和RT基因包含1～248个密码子的序列进行3个方面的质量评估：①Stop Codons（终止密码子）和Frame Shifts（移码突变）；②B、D、H、V、N（混合碱基）。如果混合碱基出现在耐药位点，可用GCG软件包进行序列比对分析，对照测序胶图比较是否在此位点出现重叠碱基峰，有可能是野生病毒株和突变病毒株共存所致；③Unusual Residues（非正常碱基）。

（5）PI Drug resistance interpretation和PR Comments：此界面说明了产生的针对蛋白酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度。

（6）NRTI and NNRTI Drug resistance interpretation和RT Comments：在上述同一界面中，此界面说明了产生的针对反转录抑制酶相关耐药位点和耐药程度。

（7）Mutation Scoring（突变评分系统）：在上述同一界面中，此界面主要根据耐药突变位点得到关于每个药物的一个记分值，分值累积得到这种药物的总分，按照总分值来判断耐药的程度。

（8）5种类型耐药突变判断标准：①敏感（0～9分），无证据表明病毒对药物敏感性降低；②潜在耐药（10～14分），病毒携带不导致耐药的突变，但这些突变的存在表示此前曾经可能有过药物选择压力的存在；③低度耐药（15～29分），病毒对于药物的敏感性已经降低和（或）病人对于治疗的病毒学指标不理想；④中度耐药（30～59分），病毒对于药物的耐受处于低度耐药和高度耐药之间；⑤高度耐药（＞60分），病毒基因型与体外实验证明耐药程度最高的毒株类似，携带有类似病毒的病人对于药物治疗一般很少或者没有病毒学反应。