抗大肠杆菌（E．coli）耐药的先导化合物虚拟筛选

毛圣超　安艳冬　黄彩敏　边榕梅　陈凯飞　宫兴文

（浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江杭州310012）

［摘 要］ 大肠杆菌（E．coli）是一种常见的致病菌，其粘肽合成酶PBP1B对细胞壁合成及存活具有至关重要的作用，是β－内酰胺类抗生素的作用靶点。但由于抗生素滥用等原因，目前已造成了大肠杆菌对β－内酰胺类抗生素较强的耐药性。该研究针对大肠杆菌的粘肽合成酶PBP1B，通过分子对接软件DOCK6．5进行虚拟筛选，以期得到具有全新结构的高亲和力的先导化合物，用于解决大肠杆菌对已有的β－内酰胺类抗生素的耐药性问题。其对含104万个化合物的ZINC数据库进行了虚拟筛选，以grid score进行了第一轮打分，得到分值在－30kcal／mol以下的化合物约6万个，从中挑选打分高的600个化合物进入第二轮筛选；采用amber score进行第二轮打分，筛出分值在－20kcal／mol以下的化合物约200个。对这些化合物进行分析，最终挑选出两种打分高并且结构新颖的先导化合物，这两种先导化合物有望进一步开发为新型抗菌药物。

［关键词］ 细菌耐药性；虚拟筛选；大肠杆菌；粘肽合成酶PBP1B；DOCK6．5

The Virtual Screening of Lead Compounds to Conquer the Drug－resistance of E．Coli

Mao Shengchao An Yandong Huang Caimin Bian Rongmei Chen Kaifeigong Xingwen

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejianggongshang University，Hangzhou Zhejiang 310012，China）

Abstract：E．coli is a kind of common pathogen，while penicillin－binding protein PBP1B of E．coli is an enzyme essential for its cell wall synthesis and survival．Therefore，PBP1B is an important target for drug discovery．In this study，to obtain leads with high affinity to PBP1B and has novel structures，we performed virtual screening with UCSF dock6．5 suite．The first round of screening was conducted usinggrid score．There were approximately 60，000 small molecules，with scores lower than－30kcal／mol，were screened out from the ZINC database containing 1，040，000 compounds．The top 600 compounds were subjected to the second round of screening．Amber score was used for the screening．Finally，200 compounds with amber scores lower than－20kcal／mol were selected for analysis and 2 of them were selected as lead compounds for further studies．The leads have novel structures and have potential to become new agents to conquer the drug－resistance E．Coli．

Key words：Drug resistance of bacteria；Virtual screening；E．coli；Penicillin－binding protein PBP1B；DOCK6．5

大肠埃希氏菌（Escherichia coli），通常大家称为大肠杆菌，是一种常见的食品病原微生物，是一种典型的人兽共患病病原。对于人类，大肠杆菌可以引起腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等疾病。人类感染致病性大肠杆菌后的主要症状包括胃痛、呕吐、腹泻和发热等，感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性也越来越严重，并出现多重耐药株，成为医学一大难题。因此，根据大肠杆菌的性质，开发新药物以满足临床医学的需要已成为药物研究者的当务之急。

大肠杆菌属革兰氏阴性细菌，其对β－内酰胺类抗生素的耐药机理包括几个方面：一是细菌外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位，即改变细菌外膜蛋白，减少抗生素的吸收；二是细胞通过主动外排过程将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外，以减少药物在细胞周质的积累，从而使细菌产生固有耐药性；三是改变抗生素的作用靶点青霉素结合蛋白（PBP）的数量或结构，以降低药物与PBP的亲和力，从而产生固有耐药；四是质粒或染色体介导的β－内酰胺酶，破坏β－内酰胺环，使抗生素失活。

β－内酰胺类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类，是指化学结构中具有β－内酰胺环的一大类抗生素，具有杀菌活性强、毒性低、适应证广及临床疗效好等优点，一直以来在临床上视为抗感染的首选抗菌药物。β－内酰胺类抗生素具有共同的抗菌作用机制，主要是通过与细菌的粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillin－binding protein，PBPs）结合而抑制细菌细胞壁的合成，属于繁殖期杀菌药。β－内酰胺抗生素能专一性地与细菌细胞内膜上的PBPs结合，干扰PBPs的正常酶功能（如干扰细胞壁肽聚糖合成），使细胞壁合成阻断。不同的β－内酰胺类抗生素与不同的PBPs结合，可引起细菌自溶、形成球形体或形成丝状细胞，最终细菌停止分裂而死亡。细胞壁在膜表面合成，主要由膜结合酶、转糖基酶和转肽基酶合成。转肽基酶抑制剂是现在在临床上使用最流行的抗生素之一。

大肠杆菌的各种粘肽合成酶中，PBP1B对于其细胞壁合成和菌体的存活起着至关重要的作用，是一个非常好的药物作用靶点。PBP1B是一个双功能的反式糖苷酶，又称肽的糖基转移酶或胞壁质酶。它包含1个跨膜（TM）螺旋，2个酶域［转糖苷酶（TG）和转肽酶（TP）］以及TMand TG和残留未知的结构和功能之间的100个氨基酸残留域组成。

由大肠杆菌耐药性以及抗生素对PBPs的作用机理可知，要防治细菌耐药性，可采取的方法有：联合用药，作用于不同PBPs的β－内酰胺类抗生素在联用时可产生协同作用；开发新药，其中包括改造现有药物，保留原有的对细菌靶位的作用，增强其作用机制但避免其耐药机制；开发辅助药物以钝化其耐药机制；应用细菌基因功能学以及蛋白质组学以发现作用于新靶位的新的抗生素。

从生物靶标大分子结构出发，寻找、设计能够与它发生相互作用并调节其功能的小分子，称为直接药物设计或合理药物设计。分子对接，即虚拟筛选，是一种基于生物靶标大分子结构的药物设计方法。分子对接方法通过将化合物三维结构数据库中的分子逐一与靶标分子进行“对接”，通过不断优化小分子化合物的位置、方向以及构象，寻找小分子与靶标生物大分子作用的最佳构象，计算其与生物大分子的相互作用能，然后对化合物数据库中所有的分子排序，即可从中找出可能与靶标分子结合的先导化合物。因此，通过分子对接，从较大的化合物数据库中选择结构上具有多样性且可能有活性的化合物参加生物活性筛选，可以提高快速发现先导化合物的概率，较快地进行后续的药理测试，加快研发进程。

本研究根据抗生素与PBPs结合的原理，选择大肠杆菌的粘肽合成酶PBP1B作为虚拟筛选的靶点，对含有104万种小分子化合物的数据库进行筛选，希望筛选出能与PBP1B特异性结合的高亲和力的先导化合物，竞争性抑制PBP1B底物的结合，从而阻断大肠杆菌的细胞壁合成。同时，通过计算机进行大规模虚拟筛选，有利于得到具有全新结构的先导化合物，它们的结构应该不同于已有的β－内酰胺类抗生素（如青霉素），从而避免被耐药细菌所产生的β－内酰胺酶降解，克服现有的β－内酰胺类抗生素（如青霉素）细菌耐药性问题，同时，这些先导化合物还可以用作β－内酰胺类抗生素的增效剂。

1．　程序和步骤

1．1　DOCK程序、Chimera程序和ZINC数据库

DOCK程序是开发最早也是目前应用最广泛的一个分子自动对接及数据库搜寻算法。该程序由美国加利福尼亚大学Kuntz等开发，选用版本为DOCK6．5。Chimera程序可以从加州大学旧金山分校计算机图形实验室下载（http：／／www．cgl．ucsf．edu／chimera）。ZINC是市售化合物中免费用于虚拟筛选的数据库。本研究的目的是为开发新型抗菌药物，因此选用的是ZINC数据库中的drug－like子数据库。

1．2　实验步骤

1．2．1 受体和配体文件的准备。

从protein data bank网站（http：／／www．pdb．org／pdb／home／home．do）搜寻大肠杆菌粘肽合成酶PBP1B与已有抗生素的复合物晶体结构，目前只有PBP1B与默诺霉素的复合物晶体结构，编号3FWM，下载该文件（3FWM．pdb）。在复合物中选择和删除配体，只剩下PBP1B的晶体结构。接着进行受体准备工作，包括去除溶剂、修正错误命名的氨基酸残基、加氢和加电荷等内容，将受体保存为mol2格式。之后，把受体去氢，另存为pdb文件。接下来准备配体文件，给配体加氢和合适的电荷。

1．2．2 生成球集。

球集是在受体分子表面的内陷位置所产生的负像（或阴影），用于代表配体分子可能结合的位点。为保证对接的精确性，利用默诺霉素的结合位点，选择距离该位点一定半径内的球集作为虚拟筛选时候的活性位点。之后，观察选择出来的球集，去除位置不佳的球体，最终得到的球集文件用作虚拟筛选时候的靶点。接着，在活性位点外面生成盒子，对筛选时小分子化合物的结构和对接时的位点变化情况进行约束。

1．2．3 生成grid文件。

本实验用的是基于网格（grid）的能量打分功能。DOCK的能量打分是一种力场评分。力场打分近似分子力学相互作用能，包含范德华力和静电吸引力。

除了需要给受体文件、盒子文件和力场文件指明所在的路径以外，其余参数均用默认值。

1．2．4 第一轮筛选：配体的柔性对接。

第一轮筛选采用柔性对接。在柔性对接时，配体是柔性的，配体的结构是会重排的，以便与受体更好地结合。

对接时，采用grid score来评价筛选出的化合物与受体的亲和力大小。计算结束后，会生成结果文件，计算过的配体分子会按打分情况由高到低进行排列，每个配体分子都会给出最优的构象和结合位点信息，可以用chimera等视图软件对配体的构象和在受体结合位点的结合情况进行观察分析。挑选出打分高的配体分子，进入第二轮筛选。

1．2．5 第二轮筛选：采用Amber score。

Amber score可以在削减计算成本的同时仍然保持精度，配体结合部位的原子距离可以保持固定。Amber score的主要优点是在执行中，无论是配体还是受体的活性部位都可以是柔性的，允许小的结构重组，重现所谓的“诱导契合”。通常使用grid等简单的初次打分功能，对大量的配体进行快速筛选，获得配体的最优位置和构象，然后，挑选出打分高的配体分子，再用amber对单个配体进行更加精细的打分。通过这种方法可以对含上百万配体分子的数据库进行快速筛选。由于能量优化和MD模拟很耗费时间，所以，采用默认的100次能量优化和3000步MD。同时，设定距离配体5的受体氨基酸残基是柔性的，构象可以变化，以便与配体更好地契合，而其余的参数多采用默认值。

2．　结果和讨论

2．1　获得受体和配体文件(www.daowen.com)

从protein data bank下载大肠杆菌粘肽合成酶PBP1B与默诺霉素的复合物晶体结构，如图17－1（a）。在复合物中选择和删除配体，即默诺霉素，只剩下大肠杆菌粘肽合成酶PBP1B的晶体结构，然后对接准备工具（Dock Prep）进行受体准备工作，包括去除溶剂、修正错误命名的氨基酸残基、加氢和加电荷等内容，如图17－1（b）。选中配体，再进行反选，则选中了复合物中除了配体以外的所有结构，然后删除，只剩下加氢、加电荷后的配体，如图17－1（c）。

2．2　生成球集

运行sphgen程序产生球集，选择距离默诺霉素10的球集，去除位置不佳的球体，最终得到由14个球体所组成的球集，用作虚拟筛选时候的靶点。围绕活性位点的盒子的距离设为5，以保障盒子的大小足够容纳小分子配体而且不影响计算速度，如图17－1（d）。

图17－1　生成受体、配体和球集文件

2．3　第一轮筛选：配体的柔性对接

对含104万个化合物的ZINC数据库进行了虚拟筛选，采用grid score评价筛选出的化合物与受体的亲和力大小，计算速度约为每天4万—5万个化合物，最终得到分值在－30 kcal／mol以下的化合物约6万个，从中挑选出打分高的600个化合物进入第二轮筛选。

2．4　第二轮筛选：采用Amber score

Amber score的运算速度比较慢，每天大概计算15—20个配体化合物，最终筛出分值在－20 kcal／mol以下的化合物约200个，选取10个进一步分析，对比它们的得分情况（表17－1）。

表17－1　筛选出的化合物的打分情况

由表17－1可以看出，虽然01717339号化合物在第一轮筛选中打分不是最高的，但在第二轮打分中却为最高，这说明第二轮的amber score打分是很重要的，必须将受体的柔性也考虑进去，这样才能得到更精确的结果。

通常，Amber得分高于－20的化合物，对受体的亲和力不高，所以表17－1中只有4种化合物是有潜力的，即ZINC01717339、ZINC01707251、ZINC02260255和ZINC00163680。图17－2中列出了这4种化合物与受体氨基酸残基间的结合情况。从图17－2可以看出，4种配体均被受体的较多氨基酸残基所包围，可能发生较多的相互作用，看上去结合得比较好。

因受体与配体结合是否牢固依赖于作用力，为进一步检验这4种化合物与受体之间的亲和力，我们利用Ligplot对先导化合物和PBP1B之间的相互作用进行了分析。从图17－3中可以看到，代号为ZINC01717339的先导化合物与PBP1B的氨基酸残基有4个疏水作用和1个氢键作用，ZINC01707251与PBP1B的氨基酸残基有3个疏水作用和2个氢键作用，而另外两个化合物与受体氨基酸残基只有两个相互作用。这与amber score的打分趋势一致，即打分越好的化合物，与受体氨基酸残基间的相互作用力越多。

从相互作用和打分的情况来看，ZINC01717339和ZINC01707251这两种化合物与受体的相互作用较多，亲和力较高，具有进一步开发的潜力。通过查询ZINC数据库，未发现这两种化合物的相关研究报道，说明是新的化合物。同时这两种化合物的结构与已有的β－内酰胺类抗生素不同，没有β－内酰胺结构，从而可以避免被耐药细菌所产生的β－内酰胺酶降解，克服现有的β－内酰胺类抗生素（如青霉素）细菌耐药性问题。同时，它们还可以用作现有的β－内酰胺类抗生素的增效剂。

图17－2　先导化合物与受体的结合情况

3．　讨 论

本研究根据抗生素与PBPs结合的原理，选择对大肠杆菌的细胞壁合成和存活起着至关重要作用的粘肽合成酶PBP1B作为虚拟筛选的靶点，对含有104万种小分子化合物的数据库进行筛选，筛选出能与PBP1B特异性结合的高亲和力的先导化合物，竞争性抑制PBP1B底物的结合，从而阻断大肠杆菌的细胞壁合成，发挥抗菌的作用。通过计算机进行大规模虚拟筛选，可以节省大量的人力、物力和财力，加强药物研发进度，并且有利于得到具有全新结构的先导化合物。全新的结构可以避免被耐药细菌所产生的β－内酰胺酶降解，克服现有的β－内酰胺类抗生素（如青霉素）容易被β－内酰胺酶降解所致的细菌耐药性问题，而且，这些先导化合物还可以用作β－内酰胺类抗生素的增效剂。在本研究中，grid score和amber score分别被用于第一轮和第二轮筛选。利用grid score筛选时，只考虑了配体的柔性，而没考虑受体的柔性，这样既可以保证筛选的速度，又可以筛选到形态匹配较好的配体分子；而在amber score中，配体和受体的柔性都得以考虑，在距配体指定距离范围内的受体结构都可以是柔性的，这样就更接近于真实状态的配体—受体之间的诱导契合，可以对候选配体分子进行更细致的对比。最后，通过对筛选出的化合物进行进一步分析，可以得到亲和力高、结构新颖的先导化合物用于后续研究。

图17－3　先导化合物与受体蛋白之间的相互作用分析

对含104万个化合物的ZINC数据库进行了虚拟筛选，以grid score进行了第一轮打分，得到分值在－30 kcal／mol以下的化合物约6万个，从中挑选出打分高的600个化合物进入第二轮筛选，采用amber score进行第二轮打分，筛出分值在－20 kcal／mol以下的化合物约200个，对这些化合物进行分析，最终挑选出ZINC01717339和ZINC01707251这两种打分高并且结构新颖的先导化合物。通过数据库搜索，未发现这两种先导化合物的相关研究报道，说明是新的化合物。这两种先导化合物有望进一步开发为新型抗菌药物，用于解决大肠杆菌的耐药性问题。

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