酶解法提取活性肽方法的研究

张敏敏　黄惠灵　许　钢

（浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江杭州310012）

［摘 要］ 以苦荞麦皮为原料，用酶水解方法提取苦荞麦中的活性肽。采用正交实验，通过极差分析结果表明，影响对苦荞麦皮中的活性肽提取率高低的主要因素排列顺序为：酶量＞时间＞温度，最佳酶解条件为温度50℃，酶量0．6g，时间2．5h。

［关键词］ 苦荞麦皮；活性肽；酶解；活性肽提取率

Research on extracting Bioactive Peptides with enzymatic lysis

Zhang Minmin Huang Huiling Xugang

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejianggongshang University，Hangzhou Zhejiang 310012，China）

Abstract：In this paper，the bitter buckwheat leather as raw material to extract bitter buckwheat skin bioactive peptides by orthogonal experiments，range analysis show that：the impact on the level of active peptide extraction rate orders：the amount of enzyme＞time＞temperature，optimum hydrolysis conditions for the temperature 50°C，the amount of enzyme 0．6g，time 2．5h，under this condition protein extraction rate of up to 10．57%．

Key words：Buckwheat skin；Bioactive peptides；Enzymolysis；Extraction rate of active peptide

1．　引　言

苦荞麦活性肽是苦荞麦皮粉经蛋白酶水解后生成的多肽和氨基酸的混合物，其更易被人体消化吸收。近年国内外科研人员不断发现由苦荞麦粉水解制得的水解产物具有降低血液胆固醇、降血压、抑制有害物的吸收、抑制乳腺癌和大肠癌的发生、抑制脂肪蓄积、抑制胆结石的形成、抗氧化以及抗衰老等功效。因此，随着人们对苦荞麦研究和开发的深入，它的营养价值和保健作用会越来越清楚，也越来越引起人们的重视。

苦荞麦活性肽的研究极具实际意义：苦荞麦作为一种经济作物来源丰富、价格低廉，可满足大规模生产的需求；自古人们就有食用荞麦制品的习惯，开发生产荞麦活性肽易为人们所接受；苦荞麦活性肽产品安全可靠，可以作为日常保健食品常年食用；开发具有抗氧化性的苦荞麦活性肽可以大幅度提高荞麦制品的附加值，拓宽荞麦的用途；值得注意的是由苦荞麦粉经酶水解制得的活性肽的研究还极少有报道。

本试验意在找到最适合的水解条件，为苦荞麦活性肽提取方法的进一步研究提供试验方法与基础。

2．　材料与方法

2．1　实验材料、化学试剂与仪器

2．1．1 实验材料。

苦荞麦皮粉：由浙江工商大学食品实验室提供，经半微量凯氏定氮法测定其蛋白质含量为2．39%。

碱性水解蛋白酶（Alcalase）：购自诺维信中国生物技术有限公司。

2．1．2 主要仪器。

表8－1　主要仪器

续 表

2．1．3 主要试剂。

氢氧化钠、柠檬酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、盐酸、碳酸钠、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂（以上所用试剂均为分析纯）。

2．2　苦荞麦皮活性肽提取

2．2．1 苦荞麦皮活性肽提取途径。

苦荞麦皮粉→溶解→热变性处理（80℃恒温水浴，30min）→调pH约（11左右）→酶解→灭酶（沸水浴10min）→调pH至4．5→离心（3000rpm，25min）→取上清液（提取液）。

2．2．2 苦荞麦皮酶解反应的正交实验设计。

在探索试验结果的基础上得到适合碱性水解蛋白酶酶解反应的相关参数，然后在此基础上对苦荞麦皮粉酶解反应的正交实验进行设计。实验因素分别是（A）水解温度、（B）酶量和（C）反应时间为条件，进行苦荞麦皮活性肽的蛋白质提取率的三因素三水平的正交实验，如表8－2所示。

表8－2　碱性蛋白酶酶解反应正交实验因素水平表L9（33）

2．3　苦荞麦皮酶解液抗氧化活性肽提取率的测定（以蛋白质含量计）

2．3．1 抗氧化活性肽提取率的测定（半微量凯氏定氮法）。

2．3．1．1 实验原理。

样品与浓硫酸共热时，有机物被破坏，其中的碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而氮转变为氨再与硫酸结合成硫酸铵留在消化液中。硫酸铵用氢氧化钠中和生成氢氧化铵，加热又分解成氨，经硼酸吸收后用标准酸液滴定，根据标准酸液的消耗量计算总氮量，再乘以换算系数，即蛋白质含量。其反应式如下：

(www.daowen.com)

2．3．1．2 苦荞麦皮酶解液中蛋白质含量的测定步骤。

吸取同一实验条件下的三组平行实验酶解液各5mL，于同一型号干燥的100mL定氮瓶中，加入0．5g硫酸铜，8g硫酸钾及25mL硫酸，摇匀后先进行样品消化，待样品消化完成后，进行凯氏定氮，做三次平行测定。按同一方法作试剂空白试验。

2．3．1．3 结果计算。

蛋白质含量的计算公式：

式中：X—样品中蛋白质的含量，%；

　V 1—样品中消耗盐酸标准液的体积，%；

　V 2—试剂空白消耗盐酸标准液的体积，%；

　C—盐酸标准液的浓度，mol／L；

　0．014—1mol／L盐酸标准液1mL相当于氮的克数；

　F—荞麦皮为5．83；

　m—样品的质量，g或mL。

2．3．1．4 苦荞麦皮总蛋白质的含量测定。

称取固体样品2g于干燥的100mL定氮瓶中，加入0．5g硫酸铜，8g硫酸钾及25mL硫酸，摇匀后先进行样品消化，待样品消化完成后，进行凯氏定氮。

2．3．1．5 苦荞麦皮抗氧化活性肽提取率的结果计算。

提取率（%）＝苦荞麦皮提取液中总蛋白／苦荞麦皮总蛋白×100%

3．　结果与讨论

3．1　苦荞麦皮酶解反应的正交实验结果与极差分析

按2．2．2苦荞麦皮酶解反应的正交试验表进行正交试验，对其活性肽提取率（%）进行测定，如表8－3所示。

表8－3　苦荞麦皮酶解反应的正交试验结果

为了解各因素对活性肽提取率（%），本文做了极差分析，如表8－4所示。

表8－4　正交试验极差分析表

从表8－4的计算结果可知：对活性肽提取率而言，极差值分析R反映出影响对活性肽提取率高低的各因素的排列顺序为：B＞C＞A，即酶量＞时间＞温度，最佳酶解条件为A 1 B3 C2，即温度50℃、酶量0．6g、时间2．5h。

3．2　由此可知最佳酶解条件为A1 B3 C2

在温度50℃、酶量0．6g、时间2．5h条件下，苦荞麦皮酶解后的活性肽提取率最好。

4．　结 论

通过以反应时的水解温度（℃）、酶量（g）和反应时间（h）为条件的三因素三水平正交实验，根据实验结果和分析可以得到以下结论。

碱性水解蛋白酶提取苦荞麦皮活性肽的最佳提取率的条件为：最佳酶解条件为A1 B3 C2，即温度50℃、酶量0．6g、时间2．5h，极差值反映出影响苦荞麦皮活性肽水解度的各因素的排列顺序为：酶量＞时间＞温度，在此条件下活性肽提取率可达最佳状态。

从本实验结果看用酶解的方法从苦荞麦皮中提取荞麦活性肽是切实可行的，这为苦荞麦皮活性肽的开发利用，提高苦荞麦的附加值做了必要的基础性工作。

［参考文献］

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