产植物乳杆菌素ZJQ植物乳杆菌ZJ317培养条件的优化

许雨辛　宋达峰　顾　青

（浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江杭州310012）

［摘 要］ 通过改变培养基配方和培养条件大幅度提高ZJ317的活性。其中酵母提取物、蔗糖较为有利于L．plantarum ZJ317产乳酸菌细菌素。结合单因子和响应面实验，获得了发酵产植物乳杆菌素ZJQ的优化培养基组成为：葡萄糖2．15%、蛋白胨1%、浓缩酵母粉2%、磷酸二氢钠0．2%、乙酸钠0．5%、柠橡酸三铵0．2%、吐温80 0．1%，4%接种量；最佳发酵条件为：37℃、20mL／50mL、180r／min、初始pH值6．5。

［关键词］ 乳酸菌素；优化；抑菌圈；成分；发酵条件

Fermentative Condition of Bacteriocin Plantaricin ZJQ Produced by Lactic Acid Bacteria

Xu Yuxin Song Dafenggu Qing

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejianggongshang University，Hangzhou Zhejiang 310012，China）

Abstract：This research changed the culture and cultural conditions can dramatically increase the activity of ZJ317．Yeast extract，sugar is more conducive to the production of L．plantarum ZJ317 bacteriocins．From strainsgrowing conditions andgrowing environment is affecting its biosynthesis．Combined with single－factor and response surface experiment，we cangain the fermentation of Lactobacillus plantarum ZJQ optimization medium：glucose 2．15% and peptone 1%，concentrated yeast 2% and 0．2% sodium dihydrogen phosphate，sodium diacetate 0．5%，lemon oak acid ammonium 0．2%，three Tween 80 0．1%，4% inoculum；best fermentation：37℃，20mL／50mL，180r／min，initial pH 6．5．

Key words：bacteriocins；optimization；antimicrobial；composition；ermentation

人类对于乳酸菌的认识和应用有着悠久的历史，在食品发酵工业中，乳酸菌是一种被广泛认可并使用的益生菌，它在自然界中分布广泛。乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属以及双歧杆菌属的一些菌种在发酵工业中有着广泛的应用，因而乳酸菌被公认为是安全的食品级微生物（GRAS），而对其起主要抑菌作用的物质，是它所生产的细菌素和发酵过程中所产生的有机酸。在食品加工中，关键问题之一是防腐保鲜，而要想达到延长保藏期，使食品流通并具有商品价值的重要措施之一是在食品加工过程中添加适量的食品防腐保鲜剂。化学防腐剂对人体都会有或多或少的毒害作用，对自然界的生态环境也会造成不利的影响。寻找一种新的代用品以减少化学防腐剂所造成的潜在危害，已为食品加工科研工作者关注。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽，能抑制许多革兰氏阳性细菌，包括食品病原菌和腐败菌的生长。由于这一特性使得细菌素具有潜在的作为食品生物防腐剂的应用前景。它具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性、大部分基因位于质粒上、相对分子质量小、含修饰氨基酸、结构复杂等特点，因而被认为是分子遗传、基因工程、蛋白质工程和食品添加剂、化妆品、皮肤保健、抑制病原菌及调节肠道菌群的好材料。1988年乳酸链球菌素（Nisin）首次作为食品添加剂得到FDA的认可，并被52个国家和地区作为食品防腐剂使用，从而促进了其他种类细菌素和在其他领域应用的研究。目前细菌素作为一种“绿色防腐剂”正日益受到人们的重视，随着饲料中益生菌的广泛推广和人们对饲料卫生的重视，细菌素在动物生产中也有着广阔的应用前景。

1．　实验材料与方法

1．1　菌种

植物乳杆菌ZJ317（Lactobacillus plantarum ZJ317）为本实验室分离所得，指示菌：藤黄微球菌10209，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1．2　培养基

MRS培养基，LB培养基（1%蛋白胨、0．5%酵母提取物、1% NaCl）。

1．3　主要仪器

BX51型多功能光学显微镜（OLYMPUS，JAPAN），PB－10型酸度计（sartorius，GER），台式高速冷冻离心机3K30（SIGAM，USA），DNA Engine Dyad PCR仪（Bio－Rad，USA），UV－1700紫外可见分光光度计（SHIMADZU，JAPAN）。

1．4　培养基的优化

首先是对MRS培养基进行单一成分的优化，取得每个成分的最佳条件，然后再用Plackett－Burman（PB）实验原理，确定3个显著性因素。并根据PB实验结果确定显著影响因素，以拟合的一阶回归方程模型的系数符号和大小来设定显著影响因素的步长和变化方向，使响应值快速逼近最大相应区间。由最陡爬坡试验逼近最大相应区域后，采用Box－Benhenken法对其进行进一步研究，以获得最佳培养基。

1．5　抑菌活性测定

牛津杯双层平板法测定抑菌圈直径。利用Nisin标准品和样品的抑菌圈直径和效价之间的比例关系进行换算。由于Nisin的扩散性能差，故常在检测培养基中加入1% Tween80以促进Nisin在琼脂中的扩散。

1．6　单因素条件的优化

培养基中的单因素有很多，这里把所有培养基的成分以及外部的因素都考虑进去进行分析，实验平行重复5次。

1．6．1 pH。将培养基调节成不同的初始pH（5．5、6．0、6．5、7．0、7．5），在30℃，180r／min下发酵24h。

1．6．2 温度。将培养基在不同培养温度下培养（30℃、32℃、35℃、37℃、42℃），180r／min下发酵24h。

1．6．3 装液量。改变各锥形瓶中培养基的装液量（10mL、20mL、30mL、35mL、40mL），在30℃，180r／min下发酵24h。

1．6．4 接种量。将植物乳杆菌ZJ317以不同的接种量接种于培养基（1%、2%、3%、4%、5%），在30℃，180r／min下发酵24h。

1．6．5 碳源。本实验研究浓度为2%的各种单糖及复合多糖对发酵产植物乳杆菌素ZJ317的影响。［2%葡萄糖（G）、2%蔗搪（S）、2%麦芽糖（M）、2%乳糖（L）］。

发酵培养基中添加1%g＋1% S、1%g＋1% L、1%g＋1% M作为外加碳源，37℃，180r／min，接种量为3%，发酵24h。

在得出了碳源的最佳组成后，进一步对碳源的浓度进行了优化，采用1%、2%、3%、4%、5% 5个浓度，37℃，180r／min，接种量为3%，发酵24h。

1．6．6 氮源。发酵培养基中添加不同的单一氮源，确定最佳单一氮源，再以此为基础配成混合氮源。再向发酵培养基中添加混合氮源作为外加氮源，37℃，180r／min，接种量为3%，发酵24h。［2%的蛋白胨（PP）、牛肉膏（BE）、酵母提取物（YE）、胰蛋白胨（TP）、柠檬酸三胺（AC）］。

1．6．7 磷酸盐。发酵培养基中分别添加2%的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，37℃，20 mL／50 mL，180r／min，接种量为3%，发酵24h。

1．6．8 吐温。在各发酵培养基中添加不同浓度的吐温80（0%、0．1%、0．2%、0．3%、0．4%、0．5%），37℃，180r／min下发酵24h。

1．7　响应面分析

响应面分析：由最陡爬坡试验逼近最大相应区域后，采用Box－Benhenken法对其进行进一步研究，以获得最佳培养基。Box－Benhenken的中心组合实验设计原理是采用适当的实验设计，确定实验点，实验设计强调实验点要尽量减少总的实验次数，实验点确定之后，按随机性原则对每个实验点进行实验，获得一定的数据，以便于进行统计分析。文章的响应面实验设计是在Plackett－Burmen实验结果的基础上，对确定影响植物乳杆菌素ZJ 317的3个主要因素根据Box－Benhnken的中心组合实验设计原理进行响应面实验设计，进一步进行3因素3水平的响应面分析实验。15个实验点可以分为两类，其一是析因点，自变量取值在A、C、E所构成的三维顶点，共有15个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差。实验结果通过多元回归分析来拟合多元二次方程。

y是预测的响应值，β0，βi，βii，βij是常数，x i，x j是编码的独立变量或因子。i表示独立变量或因子的个数，表示实验的次数，i＜j表示选择的独立变量或因子的个数必须小于实验的次数。拟合的回归方程的好坏用决定系数r2来检测。用F－检测来判断统计的重要性，回归系数的重要性用t－检验来检测。本文的中心组合实验中，接种量（A）、葡萄糖（C）和酵母粉（E）作为主要因素来确定最佳抑菌活性，因素水平的大小根据实验结果确定。

2．　实验结果及分析

2．1　单因子实验

2．1．1 pH。

表5－1　不同初始pH值对发酵产植物乳杆菌素ZJ317的影响

L．plantarum ZJ317在初始pH值为5．5—7．5之间时，其生长影响差别不大，发酵液OD600值都在2．4以上。pH值在6．0—6．5时细菌素活性最高，这和L．plantarum R260发酵产细菌素的情况相似。研究表明，植物乳杆菌ZJ317产细菌素活性随着pH的升高呈先上升后下降趋势，pH为6．5时细菌素活性最高，见表5－1。

2．1．2 温度。

表5－2　不同温度对发酵产植物乳杆菌素ZJ317的影响

培养温度从28℃到37℃时菌体都生长良好，随着培养温度的升高，发酵液的pH值略有降低，表明高温更有利于细菌产酸。当温度为37℃时，Lactobacillus plantarum ZJQ产细菌素活性最高。而菌体在35℃和37℃时生长最好。这表明细菌生长的最适温度与产细菌素的最适温度基本一致。这与Ogunbanwo（2003）等人研究的Lactobacillus brevis OG1，在30℃时最有利于产细菌素，菌体生长也最好，见表5－2。(www.daowen.com)

2．1．3 装液量。

表5－3　不同装液量对发酵产植物乳杆菌素ZJ317的影响

由表5－3可知随着装液量的增加，OD600值并未发生明显变化，说明不同装液量对菌体的生产影响不大；而抑菌圈直径先增加，随后有下降趋势，表明不同装液量对其生产细菌素的活性有较大影响。装液量为20mL，植物乳杆菌素ZJ317的效价明显大于其他装液量。

2．1．4 接种量。

表5－4　不同接种量对发酵产植物乳杆菌素ZJ317的影响

由表5－4可知随着接种量的增加，OD600值并未发生明显变化，说明不同接种量对菌体的生产影响不大；而抑菌圈直径先增加，随后有下降趋势，表明不同接种量对其生产细菌素的活性有较大影响。接种量为3%的植物乳杆菌素ZJ317的抑菌圈明显大于其他接种量。

2．1．5 培养基成分。

图5－1　培养基营养成分的优化

发酵培养基中添加不同的单一氮源，确定酵母粉为最佳单一氮源，再以浓缩酵母粉为基础配成混合氮源，30℃、60mL／250mL、180r／min下发酵24h。结果见图5－1（c）。图5－1（c）显示在缺少氮源的情况下，菌体生长不良，细菌素合成受限。只加入单一氮源时，酵母提取物既有利于细菌生长，又有利于细菌素的产生，是最佳氮源，蛋白胨其次。无机氮源柠檬酸三铵的培养基中细菌生长状况不好，发酵液的pH较高，说明柠檬酸三铵有缓冲发酵液pH的作用，作为单一氮源不利于菌体生长。

由图5－1（d）可看出L．plantarum ZJ317在各种混合氮源下都生长良好，细菌素合成比使用单一氮源有了很大的提高，加入柠檬酸三铵可以使发酵液的pH升高，进一步说明了柠檬酸三铵缓冲发酵液pH的作用，但对提高细菌素活性却没有显著影响。作为单一氮源时酵母提取物和胰蛋白胨都比较有利于细菌素的合成，但混合后产细菌素能力反而有所降低。最有利于细菌素生产的氮源组合是1%酵母提取物，1%蛋白胨，0．2%柠檬酸三铵。

由图5－1（e）可看出，发酵培养基中添加0．2%的4种磷酸盐，磷酸二氢钠最佳。

Tween80作为一种表面活性剂，它可以降低细菌菌体与培养基接触面之间的表面张力，阻止细菌素吸附在产生菌细胞表面而改善微生物细胞膜的通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外，从而进一步促进细菌素的产生和活力的增强。但在细菌素的纯化过程中，过量的Tween80会与硫酸铵反应形成沉淀，使纯化工艺的难度加大。因此，选择合适浓度的吐温80对细菌素的产生和后续纯化工作都至关重要。

图5－2　酵母粉和葡萄糖浓度对细菌素活性影响的响应面

图5－3　葡萄糖和接种量浓度对细菌素活性影响的响应面

图5－4　酵母粉和接种量浓度对细菌素活性影响的响应面

2．2　响应面分析

用Design Expert 7．1对实验结果进行分析，结果表明试验模型用二次项方程拟合最好。

对数据进行二次多项式拟合，获得酵母粉、接种量和葡萄糖对细菌素活性的二阶回归方程：

R 1＝16．78－0．40A＋0．083B－0．40C＋0．67AB＋0．63AC＋0．17BC－0．91A 2－0．70B 2－1．24C 2

对该方程进行方差分析得知，该模型极显著（P＜0．01），失拟项不显著（P＞0．05），说明该响应面设计合理；预测值和实测值之间有高度的相关性（R 2＝94．07）。

由响应面实验结果，可以通过计算得A的值为2．0，B的值为2．06，C的值为1．02，即葡萄糖的浓度为2．15%，酵母粉的浓度为2%，接种量为4%。

对应的实际值为接种量4%，酵母粉2%，葡萄糖2．15%。R1的最大估计值为12．245，在以上优化条件下进行验证试验，共进行5批次20mL试验，结果分别为11．23，10．98，11．79，11．10，10．88，试验平均值11．196±0．360。该结果与模型预测基本一致，表明所得的模型有一定的实验指导意义。

3．　讨 论

从菌株生长条件和生长环境方面研究了影响其生物合成的因素。结合单因子和响应面实验，获得了发酵产植物乳杆菌素ZJQ的优化培养基组成为：葡萄糖2．15%、蛋白胨1%、浓缩酵母粉2%、磷酸二氢钠0．2%、乙酸钠0．5%、柠橡酸三铵0．2%、吐温80 0．1%，4%接种量；最佳发酵条件为：37℃、20mL／50mL、180r／min、初始pH值6．5。

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