一、实验目的

①掌握紫外分光光度计的正确使用方法,熟悉吸收曲线的绘制;

②掌握紫外可见分光光度法进行物质的定性和定量方法;

③掌握标示量及稀释度等计算方法。

二、实验原理

维生素B12是含有Co 的有机化合物(结构式如图4-10 所示),是一种深红色结晶或结晶性粉末,其注射液为1 mL 含B12 100 μg 及500 μg 两种规格。

图4-10　维生素B12结构式

绘制B12水溶液的吸收曲线在(278 ±1)nm、(361 ±1)nm、(550 ±1)nm 波长有最大吸收,通过最大吸收峰的位置及其吸光度之比,计算其吸收系数,进行定性鉴别。根据《中国药典(2010 版)》规定,定性鉴别标准为

按照注射液的含量测定方法,在(361 ±1)nm 波长处测得的吸光度乘以48.31,既得标示量稀释液的含量(μg/mL)。

三、仪器与试剂

1)仪器

TU-1901 紫外-可见分光光度计(北京普析)。

2)试剂与材料

实验用水均为去离子水;1 cm 石英比色皿。

3)样品

B12注射液(500 μg/mL)。

四、实验步骤

1)启动仪器,预热20 min

参看紫外-可见分光光度计的说明,熟悉该仪器的性能、工作原理和使用方法。 启动仪器,预热20 min。

2)B12吸收曲线绘制(www.daowen.com)

取1 支1 mL 浓度为500 μL/mL B12注射液,倒入50 mL 容量瓶中并用去离子水稀释至刻度,摇匀。 用1 cm 石英比色皿,以去离子水为参比,在230 ~600 nm 波长测定其吸光度。 然后绘制A-λ 吸收曲线图,确定最大吸收峰位置,并计算吸光度之比进行定性。 标准品吸收曲线如图4-11。

3)计算含量

根据361 nm 波长处测定的吸光度,计算原始B12注射液的含量(μg/mL)。

图4-11　维生素B12紫外可见吸收光谱

五、数据处理

1)吸收曲线的绘制

记录不同波长下的吸光度(表4-1)。

表4-1　吸收曲线数据

以波长为横坐标,相应的吸光度为纵坐标,绘制A-λ 吸收曲线。

2)计算最大吸收波长处吸光度之比并进行定性

3)计算维生素B12注射液的含量(μg/mL)

维生素B12注射液含量测定时依据标准B12的E1%1cm361 nm =207,测定此值时,其浓度单位为1 g/100 mL。 现欲测定的B12注射液的浓度单位为μg/mL,所以须将207 换算为μg/mL 时吸收系数的数值,即

若有维生素对照品的标示量,可采用比较法进行计算

六、思考题

①简述紫外分光光度法测定维生素B12含量及定性鉴别原理。

②在用紫外分光光度法时,如果取1 mL 维生素B12 注射液,用蒸馏水稀释至25 mL,在361 nm波长处测得吸光度为0.419,计算此B12注射液每mL 所含的质量。