理论教育 新基因插入真核细胞实现有效表达

新基因插入真核细胞实现有效表达

时间:2023-11-26 理论教育 版权反馈
【摘要】:进入细胞的一小部分外源DNA 能稳定地整合到染色体DNA 中。将含有外源DNA 溶液的尖细玻璃管插入细胞核中注射DNA。被注射的小鼠细胞中,大约有2%是可存活的,并含有新的基因。逆转录病毒通常并不杀死宿主细胞。此载体携带长达6 kb 的外源序列。用此反转录病毒载体导入到转化宿主细胞中的有些基因能够有效表达。感染了此病毒的昆虫幼虫可用作高效的蛋白质工厂。基于这些大基因组病毒的工程化了的载体可高效表达插入的DNA。

新基因插入真核细胞实现有效表达

细菌是DNA 分子扩增的理想宿主细胞。它们也可作为生产许多真核和原核蛋白质的工厂。但翻译后修饰,如多肽的特异切割和碳水化合物单位的添加,是不能在细菌中进行的,因为细菌缺少其必需的酶类。因此,许多真核基因只有在真核宿主细胞中才能得以正确表达。将重组DNA 分子导入高等生物细胞的另一动机,是为了获得它们的基因是如何组织和表达的知识:在胚胎发育中,基因如何打开和关闭?一个受精卵是如何产生高度分化的、在时间和空间上有组织的生物体的?如今,这些生物学的中心问题,可以通过在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法,来富有成效地研究了。

重组DNA 分子可以通过几种方式导入动物细胞。第一种方法:用磷酸钙沉淀了的外源DNA 分子可被动物细胞吸收。进入细胞的一小部分外源DNA 能稳定地整合到染色体DNA 中。尽管该方法导入率低,但却因其易于操作而常用。第二种方法:DNA 被微注射(Microinjection)到细胞中。将含有外源DNA 溶液的尖细玻璃管(直径0.1 μm)插入细胞核中注射DNA。一个训练有素的研究者每小时可注射上百个细胞。被注射的小鼠细胞中,大约有2%是可存活的,并含有新的基因。第三种方法:可用病毒将新基因携带到动物细胞中。最有效的病毒载体为逆转录病毒(RNA 肿瘤病毒)。这种病毒经过DNA 中间体复制。其生活周期的一个显著特征是,逆转录酶作用所产生的其基因组双螺旋DNA形式,能随机整合到宿主染色体DNA 中。此病毒基因组的此种DNA 状态称为原病毒DNA(Proviral DNA),它可以借宿主细胞而高效表达并随正常细胞中的DNA 复制而复制。逆转录病毒通常并不杀死宿主细胞。用来自马洛尼小鼠白血病病毒(Maloney murine leukemia virus)的载体感染哺乳动物,可将外源基因有效地导入。此载体携带长达6 kb 的外源序列。用此反转录病毒载体导入到转化宿主细胞中的有些基因能够有效表达。(www.daowen.com)

还有两种病毒载体也被广泛应用。能在哺乳动物细胞质中复制的、含有大分子DNA的痘苗病毒(Vaccinia virus),它可以关闭宿主细胞的蛋白质合成。巴氏病毒(Baculovirus)感染昆虫细胞,易于培养。感染了此病毒的昆虫幼虫可用作高效的蛋白质工厂。基于这些大基因组病毒的工程化了的载体可高效表达插入的DNA。

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