（1）色谱柱的结构

现代高效液相色谱大多采用小粒径填料以获得高柱效，因阻力较大需要在高压下运行，这也要求色谱柱及其连接必须满足耐高压、不泄漏、接头死体积小等条件。为了保证色谱柱具有良好的密封性能，通常使用带锥套的线密封连接方式。HPLC 的色谱柱管通常为内壁抛光的不锈钢管，形状几乎全为直形。近年来，由于微粒填料和高压匀浆装柱技术的应用，大大提高了柱效，色谱柱都较短（5～30 cm），柱内径根据需要而异：一般分析柱，内径4～5 mm；凝胶色谱柱，内径3～12 mm；制备柱内径较大，可达25 mm以上。

（2）色谱柱的评价

色谱柱的类型和构型（粒度、长度、内径等）的选择通常由分离目的决定。对于特定类型的色谱柱，不同的品牌之间可能存在很大的差异。通常对色谱柱要求的主要指标包括：某指定k值的理论塔板数N；峰不对称因子（As）；两种不同溶质的选择性（α），色谱柱的反压；保留值（k）的重现性，键合相浓度；色谱柱的稳定性等。

理论塔板数（N）是色谱柱的一个重要特性指标，一支色谱柱的理论塔板数越高，则溶质从色谱柱上流出曲线的方差或峰宽越小，色谱峰越尖锐，表明色谱柱对溶质的分离能力越强，即柱效高。

提高色谱柱理论塔板数的因素包括：色谱柱填充良好；增加色谱柱长度；在最佳流速下运行；采用较小粒度填料；采用低黏度流动相；升高色谱柱温度。如果采用小分子化合物测定理论塔板数，结果偏高。

不对称的色谱峰可能导致塔板数与分离度测定不准确、定量不准确、分离度降低与检测不出峰尾中的小峰、保留值的重现性不好等问题。实际工作中，通常采用可以用峰不对称因子As表示峰形的不对称或拖尾长度，理想色谱峰的As值为0.95～1.1（绝对的对称峰为As=1.0），实际分析中被测样品的As值一般应小于1.5。

（3）液相色谱填料基质

由于HPLC 的分离过程涉及物理化学作用、流体动力学、热力学过程等，所以对固定相基质材料的物理化学性质有比较严格的要求。液相色谱固定相基质主要有无机氧化物和有机聚合物两种类型。目前，HPLC 分析中常用的几种填料类型主要包括全多孔微球、薄壳型微球、灌流色谱填料和整体材料。由于全多孔微球填料能够很好地兼顾柱效、样品容量、使用寿命、灵活性以及有效利用率等众多理想的性质，应用最为普遍。

①硅胶微粒。

硅胶及键合硅胶是开发最早、研究深入、应用广泛的HPLC 固定相，这主要是基于硅胶基质良好的物理特性与完善的制备工艺。通过控制全多孔硅胶微粒的制作工艺，能够得到平均孔径变化范围宽（如8 μm，30 μm，100 μm）、粒度选择性范围较大（10 μm，5 μm，3 μm）、孔径分布范围窄、孔结构理想的填料，能满足大、小分子的分析及制备。

用于进行键合反应制备各改性硅胶HPLC 固定相的硅胶表面需要进行活化，完全羟基化，这时硅胶表面硅羟基最大浓度约为8 μmol/m2，使用效果最佳。游离硅羟基酸性很强，能与碱性溶质产生强相互作用，因此该类硅胶固定相往往使碱性化合物保留值增加、蜂变宽、拖尾。完全羟基化的硅胶基质固定相氢化硅羟基浓度较高，有时可达总数的25%～30%，氢化硅羟基的酸性比游离硅羟基弱，有利于碱性化合物的色谱分离。

硅胶基质的纯度对许多极性化合物的分离也极为重要，硅胶中的Fe、Al、Ni、Zn 等金属杂质能与溶质配合，引起不对称或拖尾峰，甚至使化合物完全被固定相吸附，不能洗脱。硅胶晶格中的其他金属（尤其是铝）能使表面硅羧基活性增强，酸性增强。HPLC 分离，尤其是碱性与强极性化合物的分离需用高纯硅胶。(www.daowen.com)

②多孔聚合物。

聚合物填料在氨基酸、有机酸、多糖以及无机离子分离中应用较多。大多数多孔聚合物在pH 为1～13 具有良好的稳定性，可以在高pH 条件下使强碱性溶质以自由态或非电离态存在，得到较好的分离。

用C18、NH2和CN 等功能团对多孔聚合物微粒加以改性，能够得到不同选择性的正相或反相色谱固定相，-COOH、-SO3H、NH2和NR3+等改性多孔二乙烯基苯交联的聚苯乙烯聚合物可以得到离子交换色谱固定相，广泛用于生物样品的分离、提纯。

与硅胶基质的离子交换剂比较，聚合物基质离子交换剂有柱效低、分离慢的缺点，并且这种担体在不同有机改性剂中溶胀程度不同，填充床会因微粒溶胀不同而变化，在梯度洗脱中溶胀现象的影响更加明显。

③无机基质。

无机基质HPLC 固定相主要包括无机氧化物和多孔石墨化碳，相对于硅胶基质固定相，多孔石墨化碳具有特殊的性质，在极性化合物和非极性化合物的同时分离、二糖和糖肽的分离中表现出独特的优势。

不经过特殊衍生处理的石墨化碳可以作为正相、反相、离子交换等不同分离模式的色谱固定相。石墨化碳的表面与溶质存在偶极作用，对极性化合物的保留比一般烷基键合硅胶或多孔聚合物强，因此可用于分离强亲水性化合物。此外，石墨化碳固定相pH稳定性非常好，可以在低或高pH条件下运行，同时可以实现高温快速分离。

④有机-无机杂化基质。

Waters 公司采用甲基三乙氧基硅烷和四乙氧基硅烷混合前体，制备了含有无机硅与有机硅烷单元的高纯杂化球，其中有机硅烷单元分布于颗粒内部及表面，甲基约取代1/3的表面硅羟基，相对纯硅胶基质，杂化基质表面硅羟基的分布更加有序，通过键合反应引入烷基链的空间位阻作用相对减少，所以键合反应得到的固定相在表面均匀性和残留硅羟基两方面均有明显的改善。杂化硅胶微球在一定程度上结合了聚合物基质稳定性好及硅胶基质高效和机械强度高的特点，能够改善碱性化合物分离的拖尾现象，在pH为1～12的流动相条件下皆具有较好的稳定性。

⑤化学键合固定相。

化学键合固定相借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在基质上制得，在高效液相色谱的应用中占80%以上。高效液相色谱中应用化学键合相在很大程度上减弱了表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。