与气相色谱相比，液相色谱的最大特点是通过对流动相的调整，可便捷地改变分离选择性。液相色谱流动相不仅选择范围宽，而且参与实际的色谱分配过程，是影响分离效果的一个非常重要的可调因素。在实际分离分析工作中，流动相的选择和优化是液相色谱分离分析方法建立的重要内容。

（1）流动相选择的一般要求

液相色谱所采用的流动相通常为各种低沸点有机溶剂与水或缓冲溶液的混合物，对流动相选择的一般要求如下。

①黏度小。溶剂黏度大，一方面液相传质慢，柱效低；另一方面柱压降增加。流动相黏度增加一倍，柱压降也相应增加一倍，过高的柱压降给设备和操作都带来麻烦。

②沸点低，固体残留物少。固体残留物有可能堵塞溶剂输送系统的过滤器和损坏泵体及阀件。

③与检测器相适应。紫外检测器是高效液相色谱中使用最广泛的一类检测器，流动相应当在所使用波长下没有吸收或吸收很少；而当使用示差折光检测器时，应当选择折射率与样品差别较大的溶剂做流动相，以提高灵敏度。

④与色谱系统的适应性。仪器的输液部分大多是不锈钢材质，最好使用不含氯离子的流动相。

⑤溶剂的纯度。关键是要能满足检测器的要求和使用不同瓶（或批）溶剂时能获得重复的色谱保留值数据。实验中使用色谱纯试剂。

⑥毒性小，安全性好，以及可压缩性也是在选择流动相时应考虑的因素。

在气相色谱中，可供选择的载气只有三四种，它们的性质相差也不大，所以要提高柱的选择性，主要是改变固定相的性质。液相色谱则与气相色谱不同，当固定相选定时，流动相的种类、配比能显著地影响分离效果，因此流动相的选择很重要。

对于液相色谱而言，流动相又称为冲洗剂、洗脱剂或载液。它有两个作用：一是携带样品前进；二是给样品提供一个分配相，进而调节选择性，以达到令人满意的混合物分离效果。对流动相的选择要考虑分离、检测、输液系统的承受能力及色谱分离目的等各个方面。

（2）液相色谱流动相的性质

流动相所采用溶剂的性质与发展的方法直接相关，其物理和化学性质确定了方法所采用的条件。

大多数情况下，高效液相色谱的方法发展采用紫外检测器，因必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收，通常要求流动相应有较弱的紫外吸收；相反地，如采用间接紫外检测器，则应选用紫外吸收较强的溶剂。当使用示差折光检测器时，需考虑溶剂的折射率。示差折光检测器的灵敏度与流动相和样品折射率的差值成正比。高效液相色谱-质谱联用技术逐渐得到普及，为了保证系统的正常运行，并有较高的检测灵敏度，要求流动相中不应含有难分解、挥发的盐类。

可能与样品或固定相发生化学反应的溶剂不能作为色谱流动相使用。在高效液相色谱中几乎不用醛、烯及含硫化合物作为溶剂；酮和硝基化合物也很少使用。溶剂在使用前必须经纯化处理，如醚类长期存放会产生过氧化物，使用前必须除去溶剂中的过氧化物，以保证流动相溶剂的惰性。

溶剂的沸点和其黏度密切相关，低沸点溶剂的黏度通常较低。通常选用沸点高于柱温20～50 ℃，黏度不大于5×10-4 Pa·s的溶剂作为流动相。由低沸点溶剂组成的混合流动相也会因蒸发而导致组成随时间改变。使用高沸点溶剂会因其高黏度引起的流动相线速度限制而损失柱效。如要使用黏度较大的溶剂，可以加入一定比例的稀释剂或适当升高柱温。

液相色谱流动相对分离选择性的影响不仅涉及流动相与固定相的相互作用，也涉及流动相和被分离物质之间的相互作用。为了对流动相的综合作用力给出定量的描述，通常采用极性来表示溶剂与溶质的相互作用强度。

Snyder 根据罗胥耐特的溶解度数据提出了计算总的溶剂极性参数P′的方法，溶剂与乙醇、二氯六环、硝基甲烷等几种极性溶质的作用量度即为流动相的极性。纯溶剂的极性参数P′定义为

式中，Kg"为溶剂在乙醇、二氧六环、硝基甲烷中的极性分配系数。

混合溶剂的极性被定义为

式中，P′A，P′B分别为纯溶剂A，B的极性参数；φA，φB分别为溶剂A，B在混合溶剂中的体积百分比。

Snyder 也提出了一种根据溶剂与溶质分子间作用力的大小对溶剂的选择性进行分类的方法。将溶剂的选择性参数分为静电力（由偶极矩决定，Xn）、给质子力（Xd）和受质子力（Xe），分别表示溶剂的偶极作用、给予质子和接受质子的能力，三者之和为1，定义为

液相色谱流动相经常采用混合溶液，如甲醇-水、乙腈-水等。对于所选择的溶剂，必须首先了解其相互混溶性。梯度洗脱时，溶剂的混溶性会影响实际的分离效果。

（3）正相色谱流动相

在正相色谱中，由于固定相的极性大于流动相的极性，所以增加流动相的极性（P′值增大），洗脱能力增强，同时样品的k将降低。一般选择具有合适P′值的溶剂，使样品的k值为l～10。

在饱和烷烃（如正己烷）中加入一种极性较大的溶剂（如异丙醇）作为极性调节剂构成的混合溶剂是正相色谱的常用流动相组成。调节极性溶剂的浓度可以改变流动相洗脱强度。确定溶剂的极性参数P′值后，若分离选择性不好，可以改用其他类型的强溶剂。对于难以达到所需要分离选择性的情况，也可以考虑使用三元或四元溶剂体系。(www.daowen.com)

正相色谱中常用的溶剂可按其对于固定相的吸附强度进行分类。通常以溶剂强度参数ɛ0值作为衡量溶剂强度的指标。ɛ0被定义为

式中，E为吸附能；A为吸附剂的表面积。显然，ɛ0表示溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。ɛ0越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，则溶质的k值越小，即溶剂的洗脱能力越强。

在正相色谱中，二元以上的混合溶剂比纯溶剂更实用。混合溶剂系统的溶剂强度可随其组成连续变化，易于找出具有适宜溶剂强度的溶剂系统。混合溶剂也可以保持溶剂的低黏度以降低柱压和提高柱效，提高选择性改善分离。可以通过选择具有等溶剂强度但性质不同的溶剂来改善分离选择性。正相色谱分离的选择性不仅取决于ɛ0，而且也受溶质与溶剂分子间的氢键作用等二次效应的影响。

（4）反相色谱流动相

在反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大或疏水性越小的溶质，与非极性的固定相的结合越弱，越先被洗脱。

反相色谱流动相通常以水作为基础溶剂，加入一定量的能与水互溶的极性调整剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等）配制成混合流动相。极性溶剂所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，是反相色谱最常用的流动相。一般推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且黏度低，同时满足在紫外185～205 nm检测的要求。

反相液相色谱中的流动相强度由有机溶剂的浓度和类型共同决定，常用溶剂洗脱强度的强弱顺序为水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最强）。

溶剂的强度随着其极性的增加而降低。除二氯甲烷与水无法混溶外，其他溶剂都可与水混用。二氯甲烷常用来清洗被强保留样品污染的反相色谱柱。

反相色谱中有机调节剂的浓度与溶质的容量因子之间满足对数线性关系，可表示为

式中，c为有机调节剂浓度；a，C分别为与流动相性质、固定相性质有关的常数。

反相高效液相色谱分离极性和离子型化合物时常采用缓冲溶液作为流动相。缓冲溶液应具有足够高的离子强度，这样可避免出现不对称峰和峰分裂。

流动相的pH 值对可解离溶质的影响很大，在分离肽类和蛋白质等生物大分子时，经常要加入修饰性的离子对试剂。三氟乙酸是最常用的离子对试剂，使用浓度为0.1%，流动相的pH 值为2～3，可以有效地抑制氨基酸上α-羧基的解离，增加溶质的疏水性，改善分离效果。

（5）离子交换色谱流动相

离子交换色谱常用缓冲溶液作为流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留除与样品离子和树脂上的离子交换基团作用的强弱有关外，也受流动相的pH值、离子强度等的影响。pH值可改变化合物的解离程度；流动相的离子强度越高，越不利于样品的解离。

离子交换色谱多以水溶液为流动相。水不仅是理想的溶剂，同时还具有使样品离子化的特性。在以水为流动相的离子交换色谱中，溶质保留值和分离度主要通过流动相的pH值和离子强度来调节。在流动相中有时也加入少量的乙醇、四氢呋喃、乙腈等有机溶剂，以增加样品的溶解度，减少峰拖尾现象。

改变pH 值可以改变离子交换基团上可解离的H+或OH-的数目，因此流动相pH 值直接影响固定相的离子交换容量。对阳离子交换剂而言，pH值降低，交换剂的离子化受到抑制，交换容量降低，组分的保留值减小；对于阴离子交换剂而言，则恰好相反。

改变流动相的pH 值，也会影响弱电离的酸性或碱性溶质的形态分布，进而改变其保留值。pH值增大，在阴离子交换色谱中组分的保留值增大，在阳离子交换色谱中组分的保留值将减小。流动相pH 值的变化也能改变分离的选择性。使用阳离子交换剂时，常选用含磷酸根离子、甲酸根离子、醋酸根离子或柠横酸根离子的缓冲液；使用阴离子交换剂时，则常选用含氨水、吡啶等的缓冲液。

在离子交换色谱中，溶剂的强度主要取决于流动相中盐的总浓度（即离子强度），增加流动相中盐的浓度，样品离子与所加盐的离子争夺离子交换基团上反电荷位点的能力降低，保留值降低。由于不同种类的离子与离子交换剂作用强度不同，因此流动相中所加盐的类型对样品离子的保留值有很大影响，常用NaNO3来控制离子交换色谱中流动相的离子强度。

（6）体积排阻色谱流动相

体积排阻色谱法依据凝胶的孔容及孔径分布，样品相对分子质量大小、分布以及相互匹配情况实现样品的分离。由于分离效果与样品、流动相之间的相互作用无关，因此改变流动相的组成一般不会改善分离度。

目前凝胶渗透色谱多采用示差折光检测器，应使流动相的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的差别，以提高检测灵敏度。

体积排阻色谱法中流动相的选择除需满足一般的流动相选择原则外，还必须与凝胶固定相相匹配，能浸润凝胶。当采用软质凝胶时，流动相应能使凝胶溶胀。为增加样品溶解度而采用高柱温操作时，可选用高沸点溶剂。

凝胶渗透色谱主要用于高聚物相对分子质量的测定。四氢呋喃对于样品一般有良好的溶解性能和适宜的黏度，且可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被广泛使用。四氢呋喃在储运过程中特别是在光照射条件下，容易生成过氧化物，使用前应予以除去。二甲基甲酰胺、邻二氯苯、间甲酚等可在高柱温条件下使用；强极性的六氟异丙醇、三氟乙醇等，可用于粒度小于10 μm 的凝胶柱。

凝胶过滤色谱主要用于生物大分子分离，通常使用不同pH值的缓冲水溶液作为流动相。当使用亲水性有机凝胶（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶作固定相时，为消除吸附作用以及样品与基体的疏水作用，通常在流动相中添加少量无机盐，如NaCl、KCl、NH4Cl等，维持流动相的离子强度为0.1～0.5。