液-液分配色谱法的流动相和固定相都是液体。从理论上说。流动相与固定相之间应不互溶，试样溶于流动相后，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相之间进行分配。

若按照固定相与流动相之间相对极性的不同，液-液分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法。

（1）正相色谱法

正相色谱法是指采用极性固定相（如硅胶、三氧化二铝以及载有醇基、氨基和氰基的固定相）、非极性流动相的一种操作模式，这是一种根据分子的极性大小将其分离开来的液相色谱技术。最常用的填料是极性较强的硅胶，三氧化二铝也常使用。流动相一般以正己烷或环己烷等非极性溶剂作为基础溶剂。在正相色谱法中，样品分子与载体基质的基团产生特异的相互作用，与固定相发生强极性相互作用的极性样品分子将较难被洗脱，在柱内停留较长的时间。反之，极性较弱或非极性分子与硅胶之间的相互作用相对较弱，因而在柱内停留的时间较短。因此，正相色谱法是根据溶剂极性差别达到分离目的的。

正相色谱法通常用来分离中性和离子（或可电离的）化合物，并以中性样品为主。采用正相色谱法分离离子样品时可在流动相中使用水；分离碱性化合物时应在流动相中加入三乙胺；分离酸性化合物时加入乙酸或甲醛。中性样品采用反相色谱法和正相色谱法分离的效果相当，其主要差别在于两种方法的洗脱顺序相反。在正相色谱法中弱极性（疏水的）化合物先洗脱，强极性（亲水的）化合物后洗脱；而在反相色谱法中恰恰相反。在实际工作中，正相色谱法适用于以下几类样品的分离分析：①反相色谱法很难分离的异构体可采用以硅胶为固定相的正相色谱法分离分析；②根据被分离样品的极性差别进行族类分析；③易于水解样品的分离分析；④极性有机溶液中溶解度很小的高脂溶性样品的分离分析。通常正相色谱法主要用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其他有机物。

（2）反相色谱法(www.daowen.com)

反相色谱法与正相色谱法相反，是以非极性表面的载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂系统为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱法固定相也多以硅胶为基质，但通常在其表面将各种不同疏水基团通过化学反应键合到硅胶表面的游离羟基上（如在其上键合C18烷基的非极性固定相，则成为C18柱），样品中的不同组分和这些疏水基团之间有不同的疏水作用，极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的载体间的相互作用较弱，因此较快流出；反之，疏水性相对较强的分子和基质间存在较强的相互作用，在柱内保留的时间相对较长。

反相色谱法是目前液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种分离分析模式，这是因为在流动相组成改变的情况下，有机强极性溶剂能够迅速在固定相表面达到平衡，因此特别适合于改变流动相的梯度洗脱。另外，在反相色谱法中，溶质在固定相上的保留是基于分子间的非特异性疏水的相互作用。由于所有的有机化合物都存在疏水基团（能够与固定相产生相互作用），因此反相色谱法成为理想的、普遍适用的分析方法。反相色谱法适于分离分析同族化合物，带有支链的化合物比其直链同族化合物更不易保留。

在反相色谱法中，通常以极性较强的水、甲醇、乙腈为流动相，因此与正相色谱法相比，也更适于分离分析那些既不溶于有机溶剂又会与极性固定相产生强烈相互作用的极性化合物。在对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析方面，反相色谱法正受到越来越多的关注，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽及蛋白质等均可使用反相色谱法。

在色谱分离过程中，由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致保留行为的变化、柱效和分离选择性变坏等不良后果。为了更好地解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到载体（如硅胶）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，为色谱分离开辟了广阔的前景。自20 世纪70 年代以来，液相色谱法有70%～80%是在化学键合固定相上进行的。它不仅用于反相色谱法、正相色谱法，还部分用于离子交换色谱法、离子对色谱法等色谱技术上。