（一）同期发情技术

同期发情又叫做同步发情或发情控制技术。它是利用某些激素人为地控制并调整若干（供、受体）母牛在一定时间内集中发情，它可以对受控制的母牛不经过发情检查即在预定时间内同时配种受精。

现行的同期发情技术有两种途径，都是通过控制黄体即延长或缩短其寿命，降低孕酮水平，使母牛摆脱孕激素控制，从而导致卵泡同时发育，达到同期发情的目的。

同期发情的处理方法主要有以下几种。

1.孕激素处理

孕激素处理是人为地造成黄体期，控制发情。母牛处理一定时间后，同时停药即可引起母牛发情，此类孕激素包括孕酮及其合成类似物，如甲孕酮、炔诺酮、氯地孕酮、18-甲基炔诺酮等。投药方式有阴道栓塞、皮下埋植等。

2.前列腺素（PG）及其类似物处理

前列腺素处理是溶解卵巢上的黄体，中断周期黄体发育，使牛同期发情。

由于前列腺素如氯前列烯醇等仅对卵巢上功能性黄体的母牛起作用，而对群体来说，黄体存在于发情周期的各个阶段，所以必须间隔11h后再用药1次，才能使群体达到同期化。前列腺素的投药方式有肌注、宫腔或宫颈注入。

（二）超数排卵技术

超数排卵简称超排，指在母牛发情周期的适宜时间，用促性腺激素处理母牛，使卵巢比在自然情况下有较多的卵泡发育，并排出多个有受精能力的卵子。超排技术的应用，可充分发挥优良种母（供体）牛的作用，加速牛群改良。同时，这种技术也是胚胎移植的重要环节。

1.常用的超排处理方法

（1）PMSG+PGF2α法。在周期第8～12d内1次肌注PMSG2000～3000IU（老年牛剂量可大一些），48h后肌注PGF2α15～25mg或子宫灌注2～3mg，以后的2～4d内，多数母牛发情。但PMSG不宜与PGF2α同时注射，否则会导致排卵率降低。

（2）FSH+PGF2α法。在发情周期第8～12d内肌注FSH，每日2次，连注3～4d，总剂量30～40mg（第一次用量稍多，以后逐日降低），在第五次注射的同时，注射PGF2α15～25mg。必要情况下，可在牛发情后肌注GnRH（LRH～A2或LRH～A3）200～300ug。

（3）促排卵类药物。经超排处理的供体，卵巢上发育的卵泡数要多于自然发情的卵子数，仅依靠内源性促排卵激素不能达到超排目的。因此，在供体母畜出现发情时，需要静脉注射外源性HCG或GnRH、LH等，以增强排卵效果，减少卵巢上残余的卵泡数。

（4）孕激素。用孕激素作超排预处理，可以提高母牛对促性腺激素的敏感性。

超排处理应选择在发情周期的后期，即黄体消退时期，此时卵巢正处于由黄体期向卵泡期过渡。

2.提高反复进行超排处理的措施

超排应用的PMSG、HCG、FSH及LH均为大分子蛋白质制剂，对母牛作反复多次注射后体内会产生相应的抗体，使卵巢的反应逐渐减退，超排效果也随之降低。

（1）增加药物的剂量。在第二次超排处理时，可将促性腺激素的剂量加大，以达到正常的超排处理。

（2）间隔一定时间处理母牛。每进行一次超排处理，便使卵巢经历一次沉重的生理负担，需经一定时间才能恢复正常的生理机能。所以，在给供体母牛作第二次处理的间隔时间应为60～80d，第三次处理时间则需长达100d，在每一次冲取胚胎结束后，应向子宫内灌注PGF2α以加速卵巢的恢复。

（3）更换激素制剂。当连续两次使用同一种药物进行处理时，为了保持卵巢对激素的敏感性，可以更换另一种激素进行超排处理，以获得较好效果。

（三）胚胎移植技术

胚胎移植是对经超数排卵处理的供体母牛，用手术或非手术手段从其输卵管或子宫内取出若干早期胚胎，移植到经过同期发情处理的另外一群受体母牛的相同部位，以达到产生供体牛后代的目的。

1890年，英国剑桥大学的科学家Watter Heap从安哥拉母兔上取出4细胞期的2枚胚胎移植到比利时兔的输卵管内获得成功。1951年胚胎移植在牛上获得成功。我国胚胎移植技术起步较晚，最早开始于1973年，1978年在牛上胚胎移植获得成功。目前国外鲜胚移植妊娠率可达60%以上，我国鲜胚移植受胎率也达到50%～60%，冻胚为45%～50%。

1.胚胎移植的意义

（1）通过胚胎移植可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力，使优良供体免去很长的怀孕期，缩短繁殖周期，生产更多的优秀后代个体。

（2）利用超数排卵，一次可获得更多的优良胚胎，缩短世代间隔，及早进行后裔测定。

（3）提高生产效率，诱发肉牛怀双胎，即向已配种的母畜（排卵的对侧子宫角）移植一个胚胎，或者向未配种的母畜移植两个胚胎。

（4）有利于防治疾病，减少由于本交引起的生殖疾病。

（5）胚胎的冷冻保存可以使胚胎移植跨地域和时空，大大节约购买和运输活畜的费用，还可以得到免疫能力，更容易适应本地区的生态环境。

（6）胚胎的冷冻保存，可以避免因遭受意外灾害而使某一物种灭绝，费用远远低于活畜保存，并且它可与冷冻精液共同构成动物优良性状基因库。

（7）胚胎移植是研究受精作用、胚胎学和遗传学等理论问题的一种良好手段。

2.胚胎移植的发展历史

（1）初始阶段（1890—1900年）。W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。

（2）初级阶段（1900—1950年）。主要由英、美科学家在家兔、绵羊、山羊等小家畜方面进行研究，成功率为35%左右。

（3）发展阶段（1950—1970年）。日本首次在牛胚胎移植上获得成功，之后日、美采用非手术法移植成功，胚胎移植成功率达70%～80%。

（4）实用化初始阶段（1970—1980年）。加拿大和美国开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）。

（5）实用化研究阶段（1982年至今）。大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英、美、日、德等国广泛开展，克隆羊诞生。

3.胚胎移植的生理学基础

（1）母牛发情后生殖器官的发育。母牛的发情、配种都是受精妊娠的前奏，而发情、配种的结局自然就是受精和妊娠。大多数发情的母牛发情后不论是否配种，或配种后是否受精，在最初一段时期（周期黄体期），生殖系统均处于受精后的生理状态下，此时高水平孕酮使子宫内膜的组织增生和分泌机能增加及生理生化发生特异性变化，在生理机能上妊娠与未孕并无区别。这就给胚胎成功的移植和在受体内正常发育提供了理论依据。

（2）早期胚胎的游离状态。早期胚胎发育和子宫没有建立实质性联系，这使其可以脱离活体而被取出成为可能。

（3）胚胎移植不存在免疫问题。受体母畜的生殖道（子宫和输卵管）对于具有外来抗原物质的胎盘和胎膜组织，在同一物种之内，无排斥现象。

（4）胚胎和受体之间建立有效联系，保证胎儿以后的正常发育。

（5）胚胎的遗传特性不受受体的影响。

4.胚胎移植的基本原则

（1）胚胎移植前后所处环境的同一性。①供体和受体在分类学上的相同属性，即两者必须属于同一物种。②动物生理上的一致性，即受体和供体在发情时间上的同期性，一般要求相差在24h以内。③动物解剖部位的一致性，即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境相似。

（2）胚胎发育的期限。胚胎采集和移植的期限（胚胎的日龄）不能超过周期黄体的寿命，最快要在周期黄体退化之前数日进行移植。通常在供体发情配种后3～8d收集胚胎，受体同时接受移植。

（3）胚胎的质量。胚胎不应受到任何不良因素（物理、化学和微生物等）的影响而危及生命力，必须是经过鉴定确认为正常者。

（4）供、受体的状况。供体的生产性能、经济价值均须大于受体，两者均须健康无病。此外，还需强调的是胚胎移植只是空间位置的变换，而不是生理环境的改变。

5.供、受体牛选择及超数排卵处理方法

（1）供、受体牛的选择。供体母牛要有较高的生产性能，品种特征明显，体型外貌良好，遗传性能稳定，系谱清楚。年龄1.5～8岁为宜，从超排效果和便于冲胚考虑，最好选择l～2胎经产母牛。受体母牛一般选择本地黄牛、杂交牛及低产奶牛，年龄在8岁以内的性成熟母牛，青年母牛要选择体成熟并且体格较大的。供、受体母牛都要求健康无病，繁殖机能正常，没有流产史，产后60d以上，发情周期正常。直肠检查子宫及卵巢发育正常，无生殖系统疾病。母牛体格较大、膘情中等以上、性情温顺。长期空怀、子宫颈狭窄等不得作供、受体母牛。

（2）饲养管理。营养是影响母牛繁殖能力的主要因素，供、受体牛都要加强饲养管理，保证足够的优质青粗饲料、精料以及维生素、矿物质等，保证清洁饮水。农村散养牛可采取集中统一管理方式（1～2个月），加强饲养管理。

（3）供体牛超数排卵处理方法。超排药品主要有促卵泡素（FSH）、氯前列烯醇（PG）或阴道栓（CIDR）等。超排过程中供体母牛在发情后的第9～13天，连续4天早晚间隔12h肌肉注射FSH，在注射FSH的第3天用PG处理。在实际应用时，一般是同时处理多头供体和受体母牛，为达到同期化，常采用以下两种方法。

二次PG+FSH法：以国产PG和FSH为例，供体母牛在第1次肌肉注射4mlPG后，间隔10天再次注射4mlPG。在第2次肌肉注射PG后的第14天开始进行超排处理。FSH采用递减法连续4天早晚间隔12h进行注射，4天注射量分别为70IU/70IU、60IU/60IU、50IU/50IU、40IU/40IU，总量为440IU。在注射FSH的第3天，同时注射PG。注射PG后第2天（注射当天为0天），早晚各输精1次，第3天视牛的发情状况可再输精1次。

CIDR+FSH法：以进口药物为例，供体母牛在第1天植入CIDR，在第11天开始注射FSH。采用的是递减法，连续4天早晚间隔12h注射，4天注射量分别为4ml/4ml、3ml/3ml、2ml/2ml、lml/1ml。在第3天注射FSH的同时，上下午各注射1.5mlPG，在第4天上午注射FSH时取出CIDR，注射PG后的第2天（注射当天为0天）上午、下午各输精1次。再次输精与否视母牛的发情状况而定。

6.冲胚程序

（1）冲胚时间。在发情配种后的第7天（发情当天为0天）冲胚，也可在第6天或第8天冲胚。

（2）保定与麻醉。供体牛按照人工授精的要求进行保定，并用2%的普鲁卡因5～10ml作尾椎硬膜外麻醉。

（3）器械和冲胚液的准备。所有器械必须严格按无菌要求进行消毒，最后一定要用蒸水冲洗，接触胚胎的器械、容器要用冲卵液进行冲洗；冲胚前冲卵液要先预热（水浴锅或热水浸泡）到35℃～37℃。

（4）超排效果检查。在冲胚前，通过直肠检查卵巢黄体个数，可判断能冲出的胚胎个数。

7.操作步骤(www.daowen.com)

（1）用清洁温水清洗外阴后，用消毒毛巾或卫生纸擦干净。一般不用消毒药水，因其使用不当反而会对胚胎造成伤害。

（2）用扩张棒打开子宫颈通道后退出。

（3）用冲卵液内外冲洗冲卵管，并检查气球完好后装入钢芯。

（4）采用直肠把握法将冲卵管插入阴道，通过子宫颈将冲卵管插到一侧子宫角（左或右），当到达子宫角大弯部位时，将钢芯退出约3cm，并把冲卵管继续向前推进，如此反复，直到冲卵管前端到达子宫角深部。由助手用注射器冲卵管冲气孔注入9～18ml（根据子宫角大小确定）空气使气球膨胀，堵住子宫角，关闭进气孔后，将通针取出开始冲胚。

（5）助手用注射器吸取冲卵液，每次15～30ml，从冲卵管推入子宫角，注入冲卵液后术者用直肠中的手将子宫角抬高，冲卵液体就会同流，用瓶子接住或直接用注射器回收即可。一般一侧子宫角反复冲7次左右。

（6）如需冲另一侧子宫角，则按相同方法重复操作即可。

（7）冲胚时每头牛用一个容器（瓶子或滤杯）装回收液，并要注意保温和避免污染。

8.术后处理

两侧子宫冲卵完毕后，将气球内的空气放掉，把冲卵管抽回至子宫体，直接从冲卵管灌注青霉素80万IU、链霉素100万IU和氯前列烯醇4ml（用双蒸水或生理盐水稀释）。

9.检胚

（1）检胚前的准备。检胚实验室及各种器具要事先消毒，检胚的室温要求是25℃，如果气温低要提前进行升温。

（2）过滤法回收。将回收的冲卵液直接注入过滤杯，将过滤杯中留下的35ml左右回收液倒入平皿中，用冲卵液冲洗过滤杯2～3次，其液体一并冲入平皿中，然后在体视显微镜下检胚。

（3）沉淀法回收。回收液静置20min后用塑料管吸去上清液，在吸时根据虹吸原理进行，要控制（用手握紧或放松出水口）液体的流速，使其缓慢流出，并注意把上面的气泡吸尽，当吸到液面还有2～2.5cm深时，将余下的液体倒入两个培养皿中镜检。

（4）检胚。在体视显微镜6×1.5倍进行检胚。用自制的玻璃微吸管（玻璃管拉丝，后面配上一节封口的塑料管）吸取少量培养液将胚胎吸出，移入装有培养液的平皿中。

10.胚胎的质量鉴定和分级

（1）放大倍数。胚胎质量鉴定一般在放大60～200倍体视显微镜下进行，如果受体视显微镜放大倍数的限制，30倍也行。

（2）鉴定依据。在显微镜下根据胚胎分裂与否、形态色调、分裂球大小、均匀度、细胞的密度、透明带以及变性情况等鉴定。

未受精卵：没有分裂球及细胞团的卵子。

桑葚胚：发情后第5～6天冲出的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球。细胞团占据透明带内腔的大部分。

致密桑葚胚：发情后第6～7天回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔的60%～70%。

早期囊胚：发情后第7～8天冲出的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明内腔的70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层。

囊胚：发情后第7～8天回收的胚胎，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。

扩张囊胚：发情后第8～9天回收的胚胎，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。

孵育胚：在发情后第9～11天回收的胚胎，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。

（3）胚胎的分级。冲出的胚胎一般分为A、B、C、D四个等级。

A级：胚胎形态完整，轮廓清晰呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。

B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡。

C级：轮廓不清，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液体较多，变性的细胞达30%～50%。

D级：未受精卵、16细胞以下受精卵、有碎片的退化卵及变性细胞超过一半的胚胎。

A级、B级、C级胚胎为可用胚胎，其中，A级、B级为可冷冻胚胎，C级胚胎只能用于鲜胚移植，D级胚胎为不可用胚胎。

11.鲜胚移植

供、受体牛经过同期发情处理，从供体牛获得的胚胎可以移植到受体牛的子宫内。

（1）受体牛的同期化处理。受体牛的同期化是指其发情时间与供体牛基本一致，相差时间最好提前一天，受体牛处理头数一般为供体牛的5倍。

①前列腺素法。一次前列腺素（PG）法：在供体牛用前列腺素的前一天，对处于发情周期第10天的受体牛进行直肠检查，选择黄体好的受体牛一次肌肉注射前列腺素2～4ml（按牛体重大小）诱导发情，发情后第7天进行移植。

二次前列腺素（PG）法：对经直肠检查空怀的受体牛注射一次前列腺素2～4ml，11天后再次肌肉注射前列腺素2～4ml，发情后第7天进行移植。

②阴道栓加前列腺素（CIDR+PG）法。在供体母牛放入CIDR的第3天，给受体母牛放置CIDR，10天左右取出CIDR，同时肌肉注射PG4ml，发情后第7天进行移植。

（2）胚胎冲洗。在移植前要对胚胎进行冲洗，方法是在一个培养皿中，分别滴10～12滴培养液，每滴0.lml左右，用玻璃微吸管吸入培养液，挤出少量培养液后，按前述方法从培养液中取出胚胎放入第一滴培养液中，排空吸管，从第二滴培养液中吸入培养液，挤出少量培养液，从第一滴中吸出胚胎放入第二滴培养液中，如此反复直到最后一滴冲洗完毕。

（3）装细管及输胚器（枪）。用0.25ml的塑料细管，先吸入约2cm长度的培养液，再吸入lcm长度的空气，再吸入胚胎，再吸入空气，再吸入培养液，细管的两头要留有空气间隔（即7段装胚法），整个过程用微型注射器吸入。输胚器的安装基本与细管精液输精枪相同，但要特别注意无菌操作，手不能直接触摸枪帽。装好后要注意保温和避免污染，一般用灭菌卫生纸或纱布包裹头部，并尽快输入受体牛子宫。

（4）合理搭配受体和胚胎。对受体牛移植时，要考虑胚胎的发育情况和受体的发情时间。一般处于发情第6天的受体牛选用致密桑葚胚移植，处于发情第7天的受体牛选用早期囊胚移植，处于发情第8天的受体牛选用囊胚或扩张囊胚移植。

（5）输胚受体牛有两种来源。一种是用同期化处理的受体牛，另一种是根据自然发情记录来确定。不管是哪一种方法，在输胚前都必须确定受体牛处于发情周期的第7天（6～8天），并通过直肠检查卵巢上是否有明显的黄体存在，只有明确了黄体的存在并发育正常才能进行输胚，而且胚胎必须输在有黄体一侧的子宫角深处。操作方法基本同人工授精，不同的是输胚部位在有黄体侧的子宫角深部。要尽量减少对子宫的刺激，避免子宫受伤，操作最好在3min内完成。

12.胚胎冷冻与解冻

一般在专门生产胚胎或进行鲜胚移植获得的可用胚多于受体牛时可将胚胎冷冻保存。下面以乙二醇为冷冻保护液的冷冻过程如下。

（1）装管方法（乙醇为冷冻保存液的装管方法）。用微型注射器连接细管，吸入约3cm保存液、0.5cm空气、0.5cm冷冻液、0.5cm空气、含一枚胚胎的冷冻液、0.5cm空气、0.5cm冷冻液、0.5cm空气、适量保存液，即五段液体、四个气泡，边上两段液体为保存液，中间三段为冷冻液。最后用细管封口塞封口。一般要制作一个标签，注明胚胎系谱、冷冻方法、胚胎发育期及级别等。

（2）冷冻程序。用自动或半自动胚胎冷冻仪进行胚胎冷冻。程序如下：将胚胎冷冻仪的冷冻室预冷至-5.5℃，将装有胚胎的细管放入冷冻室，平衡5～10min，植冰，再平衡5～10min，然后以0.3℃/min的降温速度降温至-32℃，平衡10min后，将细管投入液氮保存。

（3）冻胚解冻。用乙二醇为冷冻保护液制作的冷冻胚胎，解冻后可直接移植。解冻程序是：从液氮中取出装有胚胎的细管—置于空气中10s—放入35℃温水中10s—灭菌棉擦干—拧下细管塞—装入移植枪。

13.妊娠诊断

在受体牛接受移植后2个月，通过直肠检查法判断是否妊娠。

（四）牛的双胎生产技术

在自然状态下，牛的双胎率因品种、胎次的不同而各异，一般为1%～4%。肉牛较奶牛的双胎率低，诱产多胎会使犊牛生产率倍增，是提高母牛繁殖率、有效增产的重要手段。人工方法诱产双胎的途径，一是通过超排后再人工授精，有可能得到双胎在同一母体子宫内自然着床，生产双胞胎；二是通过体外受精和胚胎移植技术，把两个胚胎移植到其他母体子宫内着床生产双胞胎。前者不需要劳力，比较实际，但在子宫内由于超排，多数卵的发育受胎着床的成功率还较低。后者可选定胚胎移植部位，成功率较高，使用胚胎移植技术可能得到较高的双胎率，从而扩大肉牛生产并降低饲养母牛的生产成本。目前牛的双胎生产技术研究途径有以下几种。

1.移植两枚胚胎产双犊

此法给一头受体母牛同时移植两枚胚胎，使之一次性妊娠并分娩产双犊，这是当前双胎生产的主要方法。具体有两种：一是向两侧子宫角各移植1枚胚胎；二是向黄体侧子宫角移植2枚胚胎。试验表明，采用手术法移植时，两侧子宫角各移植一枚胚胎的受胎率和双胎率分别达到70.5%和75%。向黄体侧子宫角移植两枚胚胎时受胎率和双胎率分别为66.7%和64.3%。前者效果优于后者。采用非手术法移植时（特别是移植冷冻胚胎），只需要向黄体侧子宫角移植一次（两枚），较简便，生殖道污染、黏膜损伤机会少，也较安全。

2.移植分割胚胎产双犊

此法可将一枚胚胎分割成半胚，培养后同时移植给受体母牛，就有可能生产遗传结构相同的同卵双胎犊牛。但这种方法需要熟练的切割技术和特殊设备，且受胎率和双胎率不如移植整胚高。目前在牛的育种和开展科学研究方面是一种有效的方法。

3.冷配以后，再移植一枚胚胎

虽然说牛的一侧卵巢可能同时产生两个卵子，但人工授精后形成双胎的概率极少。然而对发情母牛适时人工授精后并于发情后第7天再向无黄体侧子宫角移植一枚胚胎，有可能获得双犊。此法（先人工授精，后采用手术法移植胚胎）受胎率和双胎率分别为66.7%和64.3%，需要选择黄体大且子宫状态良好的受体母牛。

4.投入低剂量激素诱发产双犊

这就是超排技术，以减量注射促卵泡素（FSH），预前3天注射6～12mg，促进多卵泡发育，并在注射后的第二天注射前列腺素，使母牛排出一个以上卵子后，适时人工授精有可能产双犊。目前使用FSH超排时，很难控制排卵数，且易多卵泡发育而造成多胎后流产或早期胚胎死亡。

5.利用体外受精技术产双犊

利用超排和胚胎移植技术生产双犊，胚胎的采集、冷冻及分割等成本高，每枚胚胎的价格也很贵（尤其是良种胚胎）。随着体外受精技术的发展和应用，有可能大大降低胚胎的价格。利用体外受精后获得的冻胚，同时移植两枚给受体母牛，将可能成为产双犊的主流方法。

尽管通过向一头受体母牛移植两个或多个胚胎能够生产双犊或三犊，但与生产单胚相比，一头妊娠多胎的母牛易出现胚胎早期死亡、流产和早产。因而一个比较切合实际的办法是从需要培育后备牛的奶牛中生产双胎，并将这些双胎作为育肥牛出售，这样将会减少妊娠期间的损失。日本铃木等人报道，如果在妊娠第7天再进行胚胎移植，大约50%的经产牛能产双犊。双胎的妊振牛易出现能量的缺乏，故妊娠后期应对双胎鉴定（诊断），并及时给予良好的营养调控，帮助分娩等都是很必要的措施。