实验目的

1.理解酵母双杂的原理。

2.掌握酵母双杂的实验方法。

实验原理

酵母双杂交系统（Yeast-two-hybrid system）利用了真核生物转录调控因子的组件式结构特征，这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使转录的功能。实验中，首先运用基因重组技术把已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子（常为GAL1、GAL4或GCN1）DNA结合结构域编码区（BD）的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。此时，若将已知编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相链接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因的表达。

实验用品

1.材料：拟南芥AtAP3与AtPI的开放阅读框。

2.器材：培养箱，摇床，PCR仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统，超净工作台。三角瓶，离心管，枪头，烧杯，三角瓶，培养皿，镊子，剪刀，酒精灯。

3.试剂：酵母菌株AH109，pGBKT7载体（Binding domain）（Trp），pGADT7载体（Activation domain）（Leu）；20 mg/mL X-gal；Nde I，EcoR I和BamH I限制性内切酶；各种SD培养基；Z Buffer，ONPG，YPAD培养基；KAc缓冲液（pH 4.8）；溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；PEG（50%）；LiAC（1 mol/L）；ssDNA（10 mg/mL）。

（1）Z Buffer的配方：

Na2HPO4　8.5g

NaH2PO4·H2O　5.5 g

KCl　0.75 g

MgCl2·7H2O　0.246 g

补ddH2O　1 L

（2）YPAD培养基的配方：

酵母提取液　10 g

消化蛋白质　20 g

NaOH　0.1 g

补ddH2O　900 mL

高温灭菌后补加10 mL灭过菌的20%（W/V）葡萄糖。

（3）溶液Ⅰ的配方：

葡萄糖　50 mmol/L

Tris-HCl（pH 8.0）　25 mmol/L

EDTA（pH 8.0）　10 mmol/L

（4）溶液Ⅱ的配方：

NaOH　0.2 mol/L

SDS　1%（W/V）

（5）溶液Ⅲ的配方：

KOAc（5 mol/L）　60 mL

冰醋酸　11.5 mL

ddH2O　28.5 mL

（6）10×SD溶液：

L-尿嘧啶（uracil）　200 mg/L

L-腺嘌呤亚硫酸盐（Adenine hemisulfate salt）　200 mg/L

L-盐酸精氨酸（Arginine HCl）　500 mg/L

L-天冬氨酸（Aspartic acid）　1000 mg/L

L-谷氨酸（Glutamic acid）　1000 mg/L

L-异亮氨酸（Isoleucine）　300 mg/L

L-亮氨酸（Leucine）　1000 mg/L

L-盐酸赖胺酸（Lysine HCl）　500 mg/L

L-蛋氨酸（Methionine）　200 mg/L

L-苯丙氨酸（Phenylalanine）　500 mg/L

L-丝氨酸（Serine）　400 mg/L

L-苏氨酸（Threonine）　2000 mg/L

L-酪氨酸（Tyrosine）　500 mg/L

L-缬氨酸（Valine）　1500 mg/L

L-色氨酸（Tryptophan）　500 mg/L

L-组氨酸（Histidine HCl monohydrate）　200 mg/L

配置营养缺陷培养基时不能加相应的氨基酸。灭菌后置于4℃可保存1年。

（7）酵母筛选用营养缺陷培养基SD/-Trp（pH 5.8）：

酵母氮源（不含氨基酸）　6.7 g

10×SD（不含有-Trp）　100 mL

NaOH　0.1 g

琼脂　20 g

dH2O　至900 mL

高温灭菌后补加100 mL灭过菌的20%（W/V）葡萄糖。

（8）酵母筛选用营养缺陷培养基SD/-Leu（pH 5.8）：

酵母氮源（不含氨基酸）　6.7 g

10×SD（不含有-Leu）　100 mL

NaOH　0.1 g

琼脂　20 g

dH2O　至900 mL

高温灭菌后补加100 mL灭过菌的20%（W/V）葡萄糖。

（9）酵母筛选用2营养缺陷培养基SD/-Trp-His（pH 5.8）：

酵母氮源（不含氨基酸）　6.7 g

10×SD（不含有-Trp-His）　100 mL

NaOH　0.1 g

琼脂　20 g

dH2O　至900 mL

高温灭菌后补加100 mL灭过菌的20%（W/V）葡萄糖。

（10）酵母筛选用3营养缺陷培养基SD/-Leu-Trp-His（pH 5.8）：

酵母氮源（不含氨基酸）　6.7 g

10×SD（不含有-Leu-Trp-His）100 mL

NaOH　0.1 g

琼脂　20 g

dH2O　至900 mL

高温灭菌后补加100 mL灭过菌的20%（W/V）葡萄糖。

实验程序

1.AtAP3与AtPI的克隆

在NCBI中查找拟南芥AtAP3与AtPI的全长序列，PCR扩增出AtAP3与AtPI的完整读码框。根据载体pGADT7和pGBKT7载体的多克隆位点（图43-1），在AtAP3片段的5’端与3’端引入相应的酶切位点；在AtPI片段的5’端与3’端引入相应的酶切位点。

AtAP3 PCR的反应体系（50 μL）：

0.5 μL　ExTaq DNA聚合酶（Takara）

5 μL　10×Ex buffer

1 μL　dNTP（10 mmol/L）

1 μL　F Primer（10 pmol/L）（如Nde I）

1 μL　R Primer（10 pmol/L）（如EcoR I）

1 μL　cDNA

40.5 μL　ddH2O

AtPI的反应体系（50 μL）：

0.5 μL　ExTaq DNA聚合酶（Takara）

5 μL　10×Ex buffer

1 μL　dNTP（10 mmol/L）

1 μL　F Primer（10 pmol/L）（如Nde I）

1 μL　R Primer（10 pmol/L）（如BamH I）

1 μL　cDNA

40.5 μL　ddH2O

PCR反应程序：

Step 1 94 °C 3 min

Step 2 94 °C 30 s

Step 3 56 °C 30 s

Step 4 72 °C 1 min

From step 2 to step 4×35 cycles

Step 5 72 °C 10 min(www.daowen.com)

取PCR产物4 μL进行电泳检测。TianGEN PCR回收试剂盒纯化PCR产物。

2.ORF片段和载体质粒双酶切反应

AtAP3反应体系（50 μL）：

5 μL　10×H buffer

2.5 μL　Nde I

2.5 μL　EcoR I

8 μL　cDNA

32 μL　ddH2O

37 °C，过夜酶切。TianGEN PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物。载体酶切反应同上。

AtPI反应体系（50 μL）：

5 μL　10×K buffer

2.5 μL　Nde I

2.5 μL　BamH I

8 μL　cDNA

32 μL　ddH2O

37 °C，过夜酶切。TianGEN PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物。载体酶切反应同上。

3.ORF片段和载体质粒链接反应

反应体系（10 μL）：

1 μL　10×T4 ligation buffer

1 μL　T4 DNA ligase（Takara）

6 μL　insert DNA

2 μL　plasmid DNA

16 °C，过夜链接。

图43-1　pGBKT7与pGADT7载体图

4.载体构建阳性克隆的筛选与鉴定

链接产物的转化、克隆、筛选与鉴定方法同实验四十。pGADT7链接产物的筛选用的抗生素为100 μg/mL Amp，pGBKT7筛选用的抗生素为50 μg/mL Kan。阳性克隆鉴定引物为载体引物pGADT7F、pGADT7R和pGBKT7F、pGBKT7R。所得阳性克隆由华大基因测序验证。验证准确的克隆，提取质粒备用。引物序列信见表43-1。

表43-1　实验中所需的引物序列

5.载体质粒的提取

SDS碱裂解法——质粒提取。

（1）将菌液倒入2 mL离心管，4 °C，12 000 r/min，离心1 min，收集菌体。

（2）加入预冷的100 μL溶液I，涡旋沉淀，使菌体混匀。

（3）将离心管置于冰上，加入200 μL溶液Ⅱ（新配制的），轻轻颠倒几次，混匀，冰浴5 min，切勿震荡。

（4）加入冰冷的150 μL溶液Ⅲ，反复颠倒数次。冰浴10 min以上。

（5）加入等体积的氯仿∶异丙醇=24∶1混匀后，4 °C，12 000 r/min，离心10 min。

（6）将上清转移至另一个离心管中，重复步骤5。

（7）将上清转移至另一个离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。-20 °C沉淀1 h。

（8）4 °C，12 000 r/min，离心20 min，沉淀即为质粒。

（9）75%乙醇洗沉淀2次，每次5 min，残液吸净后吹干。

（10）溶于合适体积的无菌去离子水中，-20 °C保存。

6.酵母感受态细胞制备

（1）30 °C，在YPAD平板上划线培养酵母菌种AH109，2～3 d。

（2）挑选单克隆于5 mL YPAD液体培养基中，30 °C，200 r/min，过夜培养。

（3）取2 mL过夜培养物加入100 mL YPAD液体培养基中，30 °C，200 r/min，培养至OD值为0.4～0.6。

（4）转入50 mL离心管中，室温，4000 r/min，离心5 min，收菌。

（5）用25 mL ddH2O重悬菌体，室温，4000 r/min，离心5 min，收菌。25 mL ddH2O再清洗一次。

（6）用1 mL LiAC（100 mmol/L）重悬菌体，转入1.5 mL离心管中。

（7）快速离心10 s，0.5 mL LiAC（100 mmol/L）重悬菌体。分装至1.5 mL离心管中（50 μL/管），置冰上备用。

7.LiAC介导的小规模酵母转化

（1）在酵母感受态细胞中加入如下试剂：

240 μL　PEG（50%）

36 μL　LiAC（1 mol/L）

5 μL　ssDNA（10 mg/mL）（沸水变性10 min，立即冰浴）

70 μL　ddH2O。将溶液混匀。

（2）向上述细胞中加入AD和BD质粒各2 μL，充分混匀。

（3）将上述混合物30 °C温浴30 min后，加入35 μL DMSO。轻轻颠倒混匀。

（4）42 °C热激20～25 min后，立即冰浴5 min。

（5）12 000 r/min，离心1min，收菌。

（6）用1000 μL的ddH2O清洗1次。

（7）用150 μL ddH2O重悬菌体，涂于相应的SD平板（见表43-2）。

（8）30 °C，倒置培养2～7 d。

表43-2　SD平板类型与对应的重悬菌体

8.蛋白互作检测

（1）AD载体蛋白毒性检测：SD/-Leu。

分别将AtAP3-AD与AtPI-AD菌体涂于SD/-Leu的平板上，如果长出白色菌体克隆，说明AtAP3-AD与AtPI-AD蛋白无自毒性，可进一步用于蛋白互作检测。

（2）BD载体蛋白毒性检测：SD/-Trp。

分别将AtAP3-BD与AtPI-BD菌体涂于SD/-Trp的平板上，如果长出白色菌体克隆，说明AtAP3-BD与AtPI-BD蛋白无自毒性，可进一步用于蛋白互作检测。

（3）BD载体蛋白自激活检测：SD/-Trp-His。

分别将AtAP3-BD与AtPI-BD菌体涂于SD/-Trp-His的平板上，如果没有长出白色的菌体克隆，说明AtAP3-BD与AtPI-BD蛋白无自激活，可进一步用于蛋白互作检测。

（4）互作检测：SD/-Leu-Trp-His。

将AtAP3-AD、AtPI-BD菌体和AtAP3-BD、AtPI-AD菌体涂于SD/-Leu-Trp-His平板上，如果长出白色菌体克隆，说明AtAP3与AtPI有互作。进一步加入2 mL X-gal，30℃培养过夜，如有变蓝反应，可进一步说明AtAP3与AtPI两转录因子有相互作用。

9.基于分光光度法的双酵母β-galactosidase活性分析

用双酵母β-galactosidase活性分析的方法能检验转录因子间蛋白互作的强弱。

（1）实验当天用Z Buffer溶解（含27 μL β-巯基乙醇）ONPG并振荡1～2 h，浓度为4 mg/mL。

（2）准备选择性SD培养基中过夜培养的菌液5 mL，并涡旋0.5～1 min。

（3）将2 mL加入8 mL YPAD培养基中。30℃，250 r/min，揺菌培养3～5 h至细胞对

数期（OD600=0.5～0.8）。

（4）每个样准备3个重复，即3个1.5 mL EP管，每管加入1.5 mL菌液，14 000 r/min离心30 s。

（5）除去上清，每管加入1.5 mL Z Buffer并涡旋至完全悬浮。

（6）收集细胞除上清，重悬于300 μL Z Buffer（此时浓缩比例为5倍）。

（7）吸取100 μL于一新鲜的EP管，置液氮中反复冻融2次，直至细胞破碎。

（8）设一个对照只加入100 μL Z Buffer。

（9）往每个反应管和对照管加入0.7 mL Z Buffer+ß-mercaptoethanol（巯基乙醇）。

（10）每个管中马上加入160 μL ONPG，30℃温浴，并开始计时。

（11）液体变为黄色后，记录所用的时间，并加入0.4 mL，1 mol/L Na2CO3终止反应。

（12）14 000 r/min离心10 min，取上清于干净的试管中。

（13）用对照在420 nm校准分光光度计，检测每个样品的OD420。

（14）最后计算β-galactosidase值。β-galactosidase units=1000×OD420/t×V×OD600)。t=反应所用的时间（min），V=0.1 mL×浓缩因子。

实验注意事项

1.蛋白互作检测时，需要有AD载体蛋白毒性检测与BD载体蛋白毒性检测，以及BD载体蛋白的自激活检测。

2.载体与基因在链接前注意限制性内切酶的选择。

思考题与作业

1.蛋白互作检测时，为什么需要有AD载体蛋白毒性检测与BD载体蛋白毒性检测？

2.双酵母β-galactosidase活性分析有什么作用？

参考文献

Zhang S H,Zhang J S,Zhao J,et al.Distinct subfunctionalization and neofunctionalization of the Bclass MADS-box genes in Physalis floridana[J].Planta,2015,241：387–402.

Gong PC,Li J,He CY.Exon junction complex(EJC)core genes play multiple developmental roles in Physalis floridana[J].Plant Molecular Biology,2018,98：545-563.

Li Q X,Huo Q D,Wang J,et al.Expression of B-class MADS-box genes in response to variations in photoperiod is associated with chasmogamous and cleistogamous flower development in Viola philippica.BMC Plant Biology,2016,6：151.

朱玉贤,李毅.现代分子生物学[M].2版.北京：高等教育出版社,2002.

（李巧峡）