实验目的

1.理解RNAi技术诱导植物基因沉默的原理。

2.掌握RNAi技术诱导植物基因沉默的实验方法。

实验原理

基因沉默是迄今为止应用最为广泛的反向遗传学方法，它可以在转录水平（Transcriptional Gene Silencing，TGS）和转录后水平（Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS）两个不同层次上实现对基因表达的抑制从而来分析基因的功能。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是基因沉默研究中的主要应用手段，它是基于由真核生物内普遍存在的双链RNA所诱导的同源RNA降解现象而发展起来的，属于转录后水平的基因沉默。RNAi是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导细胞内同源mRNA高效特异性降解，从而使特定基因表达受抑制或使其沉默的现象。双链RNA（dsRNA）是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（single-stranded RNA，ss-RNA）的降解，在ATP作用下，经过Dicer酶，一种具有RNAaseⅢ活性的核酸酶的加工，细胞中较长的dsRNA（30 bp以上）首先被降解形成21～25 bp的小分子干扰核糖核酸（short interfering RNA，siRNA），并有效地定位目标mRNA。siRNA具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其2条链的3’端各有2个碱基突出于末端，由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC核蛋白体），再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。RNAi技术具有序列的高度特异性，抑制基因表达的高效性，沉默信号的高稳定性，沉默信号的可遗传性和可传递性的特点。

植物体中的RNAi诱导的方法有：

（1）农杆菌介导法。将带有能转录成ihpRNA的反式重复的外源基因的T-DNA质粒,通过农杆菌介导整合到植物基因组上。

（2）微弹轰击法。将dsRNA或含内含子的发夹结构RNA（iphRNA）表达载体显微注射入植物体内。

（3）病毒诱导基因沉默（VIGS）。目标序列整合入病毒基因序列,通过农杆菌介导转化ihpRNA表达。

本节实验内容主要是农杆菌介导的基因沉默技术。

实验用品

1.材料：本氏烟草种子。

2.器材：培养箱，摇床，PCR仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统，超净工作台。三角瓶，离心管，枪头，烧杯，三角瓶，培养皿，镊子，剪刀，酒精灯。

3.试剂：农杆菌LB4404，pFGC1008载体，MS培养基，15 mg/L Hyg（潮霉素），50 μg/mL kanamycin（卡那霉素），100 μg/mL rifampicin（利福平），100 μg/mL Amp（氨苄青霉素），300 mg/L Cef（头孢霉素），YEB培养基，10 mmol/L MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸），0.2 mmol/L acetosyringone（乙酰丁香酮），10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），20 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），AscⅠ，SwaⅠ，SpeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶。

实验程序

1.载体构建

根据载体pFGC1008的（见图42-1）多克隆位点，首先将目的片段与pFGC1008载体分别先用NcoⅠ，AscⅠ，SwaⅠ中的两个进行酶切，然后进行酶切片段回收，用链接接酶将二者链接起来，进行大肠杆菌的转化，筛选链接好的载体。通过引物引入相应的酶切位点，引入示范如下：(www.daowen.com)

保护碱基　SpeⅠ　AscⅠ　目标片段

AT　ACT AGT　GGCG CGCC　TTTGCCATAGAGTCTTTTC

保护碱基　BamHⅠ　SwaⅠ　目标片段

TC　GGATCC　ATTTAAAT　CCCTACTTGTAACCAAG

图42-1　pfGC1008-RNAi载体图

然后将目的片段与第一步骤链接好的载体再用BamHⅠ，PacⅠ，SpeⅠ中的两个内切酶进行酶切。然后进行酶切片段回收，用链接酶将二者链接起来，进行大肠杆菌的转化，筛选链接好的载体。酶切片段的回收、链接、转化与阳性克隆的筛选同实验四十，阳性克隆筛选的引物为目的片段的特异性引物。经过2次酶切反应与链接反应，使得载体上双向插入目的基因片段形成发卡结构。

2.无菌苗准备，本氏烟草转化，转基因植株基因型分析与转基因植株表型的分析的过程同实验四十一。

载体筛选所用抗性标记为氯霉素，浓度为30 mg/L，抗性苗所用筛选标记位潮霉素（Hyg），浓度为15 mg/L。基因型分析利用Real-time RT-PCR方法检测所得植株中目的基因及其同源基因的表达量情况。表型分析方法同同实验四十一。

参考文献

周红建,黄松,王雄伟.RNAi技术研究新进展[J].生物技术通报,2010，（12）：84-87.

黄丹莹.RNAi技术在植物基因功能研究中的应用[J].现代农业科技,2007,(18)：188-190.

Li Z C,He C Y.Physalis floridana cell number regulator1 encodes a cell membrane-anchored modulator of cell cycle and negatively controls fruit size[J].The Journal of Experimental Botany,2015,66(1)：257-270.

Zhang J S,Li Z C,Zhao J,et al.Deciphering the Physalis floridanadouble-layered-lantern 1 mutant provides insights into functional divergence of the GLOBOSA duplicates within the Solanaceae[J].Plant Physiology,2014,164(2)：748-764.

（李巧峡）