实验目的

1.理解植物病毒诱导的基因沉默的原理。

2.掌握植物病毒诱导的基因沉默的实验方法。

实验原理

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是利用RNA干扰诱导植物中目标基因沉默的技术。VIGS利用植物内源RNA介导的防御体系使得目标基因RNA与病毒RNA序列形成二聚体而得到特异性降解。携带靶基因片段的病毒载体在被感染的植物体中大量复制并且转移，病毒载体中的靶基因片段在RNA介导的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）作用下合成大量的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。dsRNA在Dicer酶作用下产生21～25个核苷酸的短干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）片段。然后，siRNA的反义链与RNA诱导基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，特异性识别细胞质中靶基因的单链mRNA，造成内源靶基因mRNA特异性降解。研究表明，在成功的植物VIGS体系中，沉默诱导子300～500 bp的双链RNA（dsRNA）片段中，至少有21～23个核苷酸序列与目标序列具有100%的同源性。VIGS在分析植物基因功能时，具有方便、快速的优点，并避开了植物遗传转化的复杂性。近年来，VIGS体系在多种双子叶与单子叶植物中已成功建立。

实验用品

1.材料：本氏烟草植株。

2.器材：培养箱，摇床，PCR仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统。三角瓶，离心管，枪头，1mL无针注射器。

3.试剂：农杆菌GV3101，pTRV1载体，pTRV2载体，50 μg/mL kanamycin（卡那霉素），100 μg/mL rifampicin（利福平），100 μg/mL Amp（氨苄青霉素），YEB培养基，LB培养基，10 mmol/L MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸），0.2 mmol/L acetosyringone（乙酰丁香酮），10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），20 mg/mL Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），Xho I与BamH I限制性内切酶，TIANprep mini plasmid kit，universal DNA Purification Kit，PrimeScript™RT Master Mix，SYBR Premix EX Taq II。

（1）YEB培养基配方：

牛肉膏　5 g

酵母提取物　1 g

胰蛋白胨　5 g

蔗糖　5 g

硫酸镁　0.4 g

琼脂粉　15 g（YEB液体培养基不需要，固体平板培养基用到）

蒸馏水　至1 L，pH=7.4。

（2）LB培养基配方：

酵母提取物　5 g

胰蛋白胨　10 g

NaCl　10 g

琼脂粉　15 g（LB液体培养基不需要，固体平板培养基用到）

蒸馏水　至1 L，pH=7.4。

实验程序

1.探针cDNA序列的PCR扩增

用Trizol法提取本氏烟草花芽的总RNA，并合成第一链cDNA。如用探针NbGLO1（来源于本氏烟草）的开放阅读框（3’端400 bp左右），根据载体pTRV2的（见图40-1）多克隆位点，在插入片段的5’端引入酶切位点Xho I，3’端引入酶切位点BamH I。用特异性引物对其序列进行特异性扩增。

图40-1　pTRV1与pTRV2载体图

PCR反应体系为（25 μL）：

0.2 μL　ExTaq聚合酶（Takara）

2.5 μL　10×ExTaq缓冲液

2 μL　2.5 mmol/L dNTP

1 μL　cDNA

1 μL　F Primer（10 pmol/L，Xho I）

1 μL　F Primer（10 pmol/L，BamH I）

17.3 μL　ddH2O

PCR扩增程序如下：

Step 1 94 °C 5 min

Step 2 94 °C 30 s

Step 3 55 °C 30 s

Step 4 72 °C 30 s

From step 2 to step 4×35 cycles

Step 5 72 °C 10 min

2.探针cDNA片段的回收

将特异扩增的PCR产物在1%的凝胶上进行电泳。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。电泳仪电压150 V，电流120 mA，电泳30 min，将凝胶置于EB中染色20 min，然后用凝胶成像系统拍照。如扩增出cDNA片段，且大小在预期的范围内，则进行片段的回收。将合适大小的条带在紫外灯下切下，放入干净的离心管中，称取重量，用TianGEN回收试剂盒纯化回收（universal DNA Purification Kit DNA纯化回收试剂盒，N2924）。用30 μL的无菌水，洗脱试剂盒中的吸附柱，回收目的cDNA片段，-20℃保存。

3.探针cDNA片段的链接、转化

探针cDNA片段4 μL与pEASY-T1克隆载体（TransGen）1 μL轻轻混合，在室温下反应5～10 min，反应结束后将离心管置于冰上。加链接产物于50 μL刚刚解冻的Trans-T1感受态细胞中（TransGen），轻弹混匀，放于冰盒中冰浴30 min。42℃水浴锅中热激45 s，立即置于冰上2 min。然后加500 μL室温的LB液体培养基，200 r/min 37℃下孵育1 h。在孵育期间，取8 μL，500 mmol/L IPTG和40 μL，20 mg/mL X-gal，避光条件下均匀涂于100 μg/mL Amp的LB培养基平板上，室温放置30 min。孵育好的菌液4000 r/min离心2 min，弃去部分上清，保留200 μL，用枪轻轻吹弹悬浮菌体，取100 μL菌液涂板，37℃倒置培养12～16 h。

4.阳性单克隆的鉴定

挑选白色克隆，置于有100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，200 r/min 37℃摇菌4 h。取0.5 μL菌液用作PCR反应的模板。用M13F，M13R（引物序列见表40-1）正反向引物鉴定重组子。

阳性单克隆鉴定的PCR反应体系为（10 μL）：

5 μL　Premix ExTaq聚合酶

0.5 μL　M13F(www.daowen.com)

0.5 μL　M13R

0.5 μL　菌液

3.5 μL　ddH2O

PCR反应程序为：

Step 1 94 °C 5 min

Step 2 94 °C 30 s

Step 3 60 °C 30 s

Step 4 72 °C 30 s

From step 2 to step 4×30 cycles

Step 5 72 °C 10 min

然后将PCR产物电泳检测，用凝胶成像系统拍照。

表40-1　实验中所用到的引物序列

5.测序及序列分析

所得阳性克隆由华大基因完成测序工作。将所测得的序列在NCBI数据库进行BLAST，确定该序列是否为目的基因的家族成员。

6.VIGS载体构建

本研究中VIGS载体为pTRV1和pTRV2。探针NbGLO1序列与pTRV2同时进行酶切，并将探针序列连接到pTRV2载体中。

酶切反应体系为（50 μL）：

5 μL　10×K buffer

2.5 μL　Xho I

2.5 μL　BamH I

8 μL　cDNA

32 μL　ddH2O

37°C，过夜酶切。TianGEN PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物。

和质粒的链接反应为（10 μL）：

1 μL　10×T4 ligation buffer

1 μL　T4 DNA ligase（Takara）

6 μL　insert DNA

2 μL　pTRV2

16 °C，过夜链接。

接下来的感受态细胞转化与阳性克隆的鉴定同3和4的方法。阳性克隆用156引物进行检测（引物序列见表40-1），并由华大进行测序，合适的阳性克隆用TIANprep mini plasmid kit（TIANGEN,Beijing,China）试剂盒提取质粒。

7.植株培养与农杆菌渗入法

用冷冻法将质粒转化到农杆菌GV3101中，将10 μL的阳性克隆质粒加入到50 μL的感受态农杆菌（GV3101）中，倒入液氮中将其快速冷冻，然后再放入37℃的水浴锅中使其溶解，反复2次。然后将含有pTRV1和pTRV2：：NbGLO1质粒的农杆菌GV3101分别涂到YEB（含50 μg/mL kanamycin和100 μg/mL rifampicin）平板上，28℃培养。2 d后，挑选单个克隆于5 mL的YEB液体培养基（含50 μg/mL kanamycin和100 μg/mL rifampicin）中，28℃，250 r/min小摇过夜。随后将小摇过夜的菌液混合于250 mL的YEB液体培养基（含50 μg/mL kanamycin 100 μg/mL，rifampicin，10 mmol/L MES和0.2 mmol/L acetosyringone）中，28℃，250 r/min大摇。待菌液在600 nm处OD值达到2.0左右时，收集菌液。菌液进一步用渗透缓冲液（10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L MES,and 200 mmol/L acetosyringone）重悬，并在室温下孵育3h，之后将含有pTRV1和pTRV2：：NbGLO1质粒的农杆菌GV3101的渗透液按照1∶1的比例进行混合。然后用1 mL无针的注射器将混合液注射到4真叶本氏烟草所有叶子的下表皮中。暗培养2 d，随后置于光照培养箱，22～25℃、光照强度120 umol·m-2·s-1、空气湿度为48%、16h光照条件下培养。

8.qRT-PCR分析

VIGS实验后，为了检验本氏烟草中NbGLO1的表达量，取本氏烟草花芽为材料，TRIZOL法提取总RNA，PrimeScript™RT Master Mix（TAKARA，047A）试剂盒将其反转录成cDNA，SYBR Premix EX Taq II进行qRT-PCR分析。用DNAman软件设计Nb-GLO1的特异引物，以Nbactin为内参基因（特异引物序列见表40-1）。扩增程序为95℃变性30 s，接着95 °C变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。实验过程中3次独立的生物实验样本。采用2-△△Ct法相对定量分析数据。

9.形态观察

将本氏烟草花芽置于OLYMPUS(DP2-BSW-V2.2,Olympus公司，Tokyo，Japan)体视显微镜下解剖，并拍照，得到花芽与雄蕊的形态结构。

实验注意事项

1.探针cDNA序列一定要引入正确的限制性内切酶位点。

2.EB染色凝胶时，一定注意安全，戴上手套与口罩。

3.cDNA片段回收时，用刀片切取合适大小的条带，尽量除去多余的凝胶。

4.cDNA片段转化时，注意感受态细胞解冻时间不易太长。

5.实验过程中，应设一个阴性对照，即将没有链接探针序列的pTRV1和pTRV2注射到植物叶片中，观察植株有无明显的表型变化。

思考题与作业

1.选取限制性内切酶时，应该注意什么？

2.VIGS实验后，为什么需检验本氏烟草中NbGLO1的表达量？

参考文献

Zhang S H,Zhang J S,Zhao J,et al.Distinct subfunctionalization and neofunctionalization of the Bclass MADS-box genes in Physalis floridana[J].Planta,2015,241：387-402.

Gong P C,Li J,He C Y.Exon junction complex(EJC)core genes play multiple developmental roles in Physalis floridana[J].Plant Molecular Biology,2018,98：545-563.

Li Q X,Wang J,Zheng S,et al.Virus-induced gene silencing in Nicotiana benthamiana trigged by the heterologous gene sequence from Viola philippica[J].Biologia Plantarum,2019,63(1)：153-163.

（李巧峡）