实验目的

1.掌握原位杂交的基本原理。

2.学会利用原位杂交的方法分析基因的表达。

3.了解AtAP3和AtPI这两个基因的转录产物在拟南芥花芽中的定位与定量。

实验原理

原位杂交（in situ hybridization）始于20世纪60年代，1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno-Nardelli和Amaldi、John及其同事相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创立了原位杂交技术。原位杂交是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，在适宜条件下形成稳定的杂交体，然后再应用于标记物相应的检测系统，所形成的杂交体经显色反应后在显微镜下观察细胞内相应的mRNA、rRNA、tRNA分子。这一技术为研究组织和细胞中编码各种蛋白质和多肽相应mRNA的定位与定量提供了手段。这种技术与其他分析基因表达的方法不同，别的技术例如RT-PCR、免疫印迹、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳等都有一个共同的缺点：都依赖于组织匀浆来提取细胞成分，所观察到的信号必然是匀浆中整个细胞群体的一种平均值，而无法获得组织及细胞类型特异性表达方面的资料，无法知道各种组织细胞的基因表达情况。因此，RNA原位杂交技术成为了在组织水平分析基因的表达和功能的有效方法。

RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或RNA分子。根据在RNA杂交中所使用探针根据来源分为特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。根据标记物分为同位素标记和非同位素标记。非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱基磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素。近年来，地高辛标记技术引起科技工作者极大的兴趣，地高辛较放射性标记系统安全、方便、省时，同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术优越。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色，有较好的反差背景。

实验材料

1.材料：拟南芥不同发育阶段的花芽。

2.器材：枪头，EP管，烧杯，染缸，量筒，移液枪，载玻片，盖玻片，一次性手套，酒精灯，磁力搅拌器，超净工作台，恒温水浴锅，高压灭菌锅，超低温离心机，组织包埋机，手摇切片机，展台，杂交炉等。

3.试剂：

（1）组织固定液的配置。

1×PBS　80 mL（0.1% DEPC-H2O配置）

多聚甲醛（PFA）　4 g

NaOH　若干颗

在60℃水浴中溶解，再用H2SO4（100 mL,1～2滴），pH调至7.0～7.2，定容至100 mL。4℃保存。

（2）制备切片的试剂。

①0.01%多聚赖氨酸粘片剂。

②pH 7.6磷酸盐缓冲液（PBS）。脱水剂或复水剂：30%、50%、70%、85%、95%和无水乙醇。其中30%、50%、70%、85%的乙醇由0.1% DEPC-H2O配置配备。二甲苯。包埋剂：高纯度石蜡。

（3）探针制备试剂。

RNA聚　合　酶（sp6或T7）；10×Transcription buffer；DIG RNA 10×Labeling Mix；RNase inhibitor；PCR产物（100～200 ng）；DEPC-H2O。

（4）切片的预处理试剂。

①20 mg/ml Proteinase K

Proteinase K　40 mg

0.1% DEPC-H2O　2 mL

Store at-20℃。

②蛋白酶K消化缓冲液：（RNase-free）

Tris（pH=8.0）　100 mmol/L

EDTA（pH=8.0）　50 mmol/L。

乙酸酐处理液：0.25%乙酸酐，临用前用0.1 mol/L三乙醇胺（pH 8.0）配制。

（5）杂交缓冲液。

①杂交缓冲液配方：　10 mL

甲酰胺　5.0 mL

50%硫酸葡聚糖　2.0 mL

10×杂交盐　1.0 mL

50×denhardt’s　0.2 mL

50 mg/mL tRNA　0.1 mL

DEPC-H2O　1.7 mL

分装在1.5 mL EP管中，-20℃保存。

②10×杂交盐配方：

Tris（pH=7.5）　100 mmol/L

EDTA（pH=8.0）　10 mmol/L

NaCl　3 mol/L

（5）其他溶液配方。

①2%甘氨酸（RNase-free）：

Gycline　5 g

DEPC-H2O　至250 mL

②20×SSC（RNase-free）：

NaCl　3 mol/L

柠檬酸钠　0.3 mol/L

③Maleic acid buffer（100 mmol/L Maleic acid，150 mmol/L NaCl，pH=7.5）：

Maleic acid　5.8 g

NaCl　4.38 g

NaOH　调pH=7.5

DEPC-H2O　至500 mL

④10% Roche blocking stock solution（原液）：

Roche blocking（powder）　20 g

Add maleic acid buffer　至200 mL

分装在10 mL的小管中，-20℃保存。

⑤10×PBS（RNase-free，1000 mL）：

NaH2PO4·2H2O　4.68 g

Na2HPO4·12H2O　25.07 g

NaCl　75.97 g

⑥0.25 mol/L HCl（RNase-free，现配现用）：

HCl　4.31 mL　862 μL

DEPC-H2O　至200 mL　40 mL

⑦1 mol/L MgCl2：

MgCl2·6H2O　203.3g　101.65g　50.8g　20.33g

ddH2O　至1L　500 mL　250 mL　100 mL

⑧4% formaldenhyde甲醛（RNase-free）：

37% formaldenhyde　10.8 mL　4.32 mL

10×PBS　10 mL　4 mL

DEPC-H2O　29.2 mL　31.68 mL

共100 mL　40 mL

⑨0.2 mol/L三乙醇胺（RNase-free，现配现用）：

三乙醇胺　0.005 mL

DEPC-H2O　至40 mL

用HCl调pH=8.0（大约需90或95 μL）。

⑩1 mol/L Tris（pH=9.5，pH=8.0，pH=7.5）：

Tris　121.1g

HCl　调pH=8.0、9.5、7.5

ddH2O　至1L

5 mol/L NaCl：

NaCl　146 g

ddH2O　至500 mL

10×TBS（1 mol/L Tris pH=7.5，1.5 mol/L NaCl）：

Tris　121.1g

NaCl　87.75g

ddH2O　至1L

NTE：

5 mol/L NaCl　100 mL

1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）　10 mL

0.5 mol/L EDTA　2 mL

ddH2O　至1L

Roche blocking solution：1% in 1×TBS

10×TBS　4 mL

10% Roche blocking　4 mL

ddH2O　2 mL

共40 mL

1% BSA/0.3% Tris/TBS

BSA　2.5 g　2 g

Triton X-100　750 μL　600 μL

10×TBS　25 mL　20 mL

ddH2O　至250 mL　200 mL

Buffer 3（0.1 mol/L Tris-HCl pH=9.5，0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2）：(www.daowen.com)

1 mol/L Tris（pH=9.5）100 mL　10 mL

5 mol/L NaCl　20 mL　2 mL

1 mol/L MgCl2　50 mL　5 mL

ddH2O　至1L　100 mL

NBT/BCIP显色液：

NBT/BCIP stock solution　20 μL

1 mol/L Tris（pH=9.5）　100 μL

5 mol/L NaCl　20 μL

ddH2O　860 μL

Anti-DIG-AP。

CC/Moμnt封片剂。

实验程序

1.花芽的固定

将不同花型不同发育阶段的花芽置于装有RNase-free的4%多聚甲醛固定液的青霉素小瓶中，parafilm膜封好瓶口，扎几个小孔，用真空仪抽去材料中的空气,使其沉淀下来，4 °C过夜固定。

2.花芽的包埋

（1）将固定后的花芽用30%、50%、60%、70%、85%、95%、100%乙醇进行梯度脱水，每级1 h。不同梯度乙醇均用DEPC-H2O配取。脱水的全过程均在4 °C中进行，100%乙醇中过夜。

（2）4 °C中取出，先在室温复温1 h，然后用100%、100%乙醇、25%二甲苯-75%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、75%二甲苯-25%乙醇分别置换，每级1 h。

（3）100%二甲苯透明2次，每次1 h。

（4）往二甲苯里加入等体积的石蜡片（Sigma，P3683），同时加入10%的氯仿，以使石蜡慢慢溶解，室温下过夜。

（5）次日，将青霉素小瓶放入42 °C温箱里，直至剩余的石蜡完全溶解。

（6）再加入适量的石蜡片，42 °C放置直至石蜡完全溶解。如此重复2～3次。

（7）用融化的纯石蜡换取瓶里的二甲苯-石蜡混合液，60 °C温箱里放置8 h左右，再换新鲜的融化的纯石蜡。重复此步骤至少6次。

（8）包埋样品，在石蜡凝固前把花芽摆正。将样品块放在包埋机上的冰台上快速冷却。将包埋好的样品块置于4 °C冰箱里保存。

3.石蜡切片

（1）按照纵切方向修块，将其粘在小木块上。再在木块上将蜡块修成长方体或正方体。

（2）切片7 μm厚，切成蜡带，并展开放于一张干净的白纸上。

（3）将蜡带切段并铺于滴有DEPC-H2O的0.01%多聚赖氨酸载玻片上，在42 °C展台上使其展片。

（4）将切片摆正、拉直，吸干水分。烤干后放入切片盒中，在42 °C温箱中烘烤36～48 h后4 °C保存。

4.探针的合成

探针尽量选择在AtAP3和AtPI cDNA序列中比较特异的C区。给正向引物与反向互补引物分别加上“TAATACGACTCACTATAGGG”核苷酸序列以制备反义探针引物与正义探针引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为（50 μL）：

0.4 μL　ExTaq聚合酶

5 μL　10×ExTaq缓冲液

4 μL　2.5 mmol/L dNTP

2 μL　cDNA

2 μL　F Primer（10 pmol/L）

2 μL　F Primer（10 pmol/L）

34.6 μL　ddH2O

PCR扩增程序如下：

Step 1 94 °C 5 min

Step 2 94 °C 30 s

Step 3 56 °C 30 s

Step 4 72 °C 30 s

From step 2 to step 4×35 cycles

Step 5 72 °C 10 min

将目的片段电泳检测并进行切胶回收，回收产物用DEPC水溶解。将PCR产物先用超微量分光光度计测定其浓度，然后转录成RNA，用T7 RNA聚合酶催化合成带有地高辛标记的反义与正义探针（确保无RNA酶污染）。

（1）转录体系为（10 μL）：

1 μL　10×Transcription Bμffer

1 μL　10×Labeling Mix

1 μL　T7 RNA polymerase

1 μL　RNase inhibitor

1 μL　PCR产物（100～200 ng）

4 μL　DEPC-H2O

（2）将上述体系在42 °C水浴中温浴1 h。

（3）加入10 μL DEPC-H2O，2 μL DNaseⅠ。37 °C水浴中15 min。

（4）加入0.5 μL tRNA（10 mg/mL），2 μL 0.2 mol/L EDTA（pH 8.0）。终止反应。

（5）用LiCL-乙醇沉淀，-20 °C过夜。

（6）次日12 000 r/min，4 °C离心30 min。

（7）用RNase-Free的70%乙醇清洗2次，12 000 r/min，4 °C离心5 min。

（8）风干，最后溶于45 μL 50%的甲酰胺中，并分装10 μL/管，-80 °C保存。

（9）2 μL电泳检测RNA探针质量。

5.切片的预处理

（1）室温，脱蜡复水：100%二甲苯、100%二甲苯、75%二甲苯-25%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、25%二甲苯-75%乙醇，每级10 min；100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、DEPC-H2O、DEPC-H2O，每级2 min。

（2）蛋白酶K消化：蛋白酶K缓冲液37 °C预热后，加入蛋白酶K至5 μg/mL，37 °C水浴中处理30 min。室温，1×PBS，2 min。

（3）室温，0.2%甘氨酸处理2 min。1×PBS、1×PBS，每级2 min。

（4）室温，4%甲醛再固定10 min。1×PBS、1×PBS，每级5 min。

（5）室温，乙酰化：将160 μL浓盐酸，536 μL三乙醇胺溶液加入到40 mL DEPCH2O中，同时加入乙酸酐100 μL至浓度0.25%（250 μL/100 mL），快速搅拌。10 min。

（6）室温，1×PBS、1×PBS，每级5 min。

（7）脱水：DEPC-H2O、DEPC-H2O、30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇，每级1 min。

6.杂交

（1）探针预处理：吸取5 μL探针，再吸取95 μL 50%甲酰胺至100 μL。80 °C变性探针2 min后，立即冰浴。

（2）杂交：用2倍体积的杂交液稀释探针，覆盖到预处理过的切片表面。将切片放入湿盒中置于杂交炉中50 °C过夜杂交。

7.洗脱及检测

（1）洗去杂交液：50 °C，2×SSC、1×SSC、0.5×SSC，每级30 min。

（2）除去未结合的探针：37°C，NTE、NTE，每级5 min；RNase A（25 μg/mL），30 min；NTE、NTE，每级5 min。

（3）洗掉非特异性结合的探针：50 °C，0.5×SSC，60 min。

（4）封闭抗体非特异结合位点：室温，1×TBS，5 min；1% Roche Blocking Reagent，45 min。

（5）结合抗体：1% BSA/0.3% Triton/TBS，45 min；1∶1000稀释Anti-DIG-AP至1%BSA/0.3% Triton/TBS，将抗体溶液滴加到切片上，用parafilm膜盖好，然后放入湿盒，室温放置2 h。

（6）洗去未结合的抗体：室温，1% BSA/0.3% Triton/TBS，15 min，洗4次。

（7）显色：用Buffer 3连续处理2次，每次5 min；每张片子滴加200 μL 1%（V/V）碱性磷酸酯酶显色试剂（NBT/BCIP），室温下黑暗环境中在湿盒里静置过夜。

8.封片观察

用CC/Mount（Sigma）封片，70℃烤片2 h。然后在莱卡光学显微镜下观察拍照。

实验注意事项

1.器械、试剂盒溶液进行消毒处理，以消除RNA酶。

2.切片若长期不用，石蜡切片可在4℃干燥环境下保存2～3周，在-70℃干燥密封条件，可保存数月或一年。从冰箱取出开封后，应在室温下回温1h以上或用吹风机吹干后使用。

3.制成的石蜡切片置37～42℃烤箱中过夜后方可进行原位杂交。

4.最佳的探针浓度要通过试验来确定，一般为0.5～5.0 μg/mL。

5.探针的长度是影响探针弥散穿透速度的主要原因，一般以100～200个碱基为宜，但200～500个碱基的探针仍可使用，但探针过长，虽可提高杂交强度，但由于其穿透力的降低而使得核酸的检测变得困难。

6.最佳的杂交温度应是获取最高杂交率的温度。杂交温度应比杂交体的融解或解链温度低20～30℃，在30～60℃之间。

7.杂交反应可在4～6 h内完成。在试剂操作中，一般杂交时间定为16～20 h，或为了工作的方便，标本于杂交液内孵育过夜。杂交时间不应超过24 h，不然形成的杂交体会解链，减弱杂交信号。

8.在杂交后漂洗过程中，必须注意防止切片干燥，否则，即使再用大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，影响杂交反应结果。

9.为了检查原位杂交方法的有效性和核酸探针的特异性，必须设置对照试验。对照试验有：已知阳性组织和已知阴性组织对照，用相应探针在已知含靶核酸序列的阳性组织和已知不含靶核酸序列的阴性组织；用有意义链RNA探针进行原位杂交的阴性对照；在进行原位杂交时，杂交液中省去标记探针的空白试验阴性对照。

思考题与作业

1.简述原位杂交的原理。在拟南芥花芽发育过程中，RNA原位杂交与其他分析基因表达方法相比较，有什么优点？

2.原位杂交探针的标记物有哪些，各有什么优缺点？

3.RNA原位杂交探针如何制备？

4.石蜡切片的好坏对原位杂交结果影响很大，因此在制作石蜡切片过程中，应注意哪些问题？

参考文献

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（李巧峡）