实验目的

1.掌握实时荧光定量PCR的实验原理与方法。

2.能利用实时荧光定量PCR技术分析植物花发育中某些基因在RNA水平的表达情况。

3.了解AtSOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTNAS 1）在拟南芥茎尖的表达情况。

实验原理

定量PCR旨在评估样本中靶基因的分子数，用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后PCR产物的量来判断样品中原始模板的量。实时荧光定量PCR就是通过对PCR过程中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也按比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；平台期扩增产物不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR的技术检测模式包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，常用的探针类有分子信标和Taq-Man探针。非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，常用的荧光类染料为SYBR Green I。探针类检测模式由于增加了探针的识别步骤，虽特异性高，但比较麻烦。而非探针类则简便易行，其中SYBR Green I是近几年来实时荧光定量PCR技术研究中最常用的荧光类染料。SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。

实验用品

1.材料：拟南芥茎尖顶端分生组织以及相应时期的嫩叶。

2.器材：实时定量PCR仪，冷冻离心机，恒温水浴锅，高压灭菌锅。0.2 ml薄壁PCR离心管，EP管。

3.试剂：TRIZOL试剂，Ambion’s DNA-free kit试剂盒，dT15引物，dNTP，M-MLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，Taq聚合酶，AtSOC1上下引物，β-tubulin（TUB2）的上下引物，SYBR Green I试剂盒。

实验程序

1.利用TRIZOL试剂提取拟南芥茎尖总RNA。

2.DNase（Ambion’s DNA-free kit试剂盒）处理RNA除去DNA污染。

3.RNA逆转录生成cDNA，反应体系为：2.5 μg RNA模板，4 μL 5×逆转录酶缓冲液，1 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL），2 μL dT15引物（0.05 μg/μL），1 μL M-MLV逆转录酶（200 U/μL），DEPC水溶液加到总体积20 μL。轻柔搅拌混匀。室温放置10 min后，移至42℃恒温水浴锅内，反应1 h，95℃放置5 min。反应结束后置于冰中冷却2 min。逆转录后的产物放置于-20℃保存。

4.cDNA用灭菌的超纯水稀释至100 μL，取2 μL进行PCR。

5.qRT-PCR的反应体系为（25 μL）：

12.5 μL　SYBR Premix Ex Taq

2 μL　模板cDNA

1 μL　F Primer（10 pmol/L）

1 μL　F Primer（10 pmol/L）(www.daowen.com)

8.5μL　ddH2O

qRT-PCR的反应程序为：

Step 1　95°C　30 s

Step 2　95°C　5 s

Step 3　60°C　30 s

From step 2 to step 3×40 cycles

AtSOC1定量的特异上下游引物根据Genbank提供的序列设计，管家基因β-tubulin（TUB2）为阳性对照基因，其上下引物为：5’-CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3’和5’-TCACCT TCTTCATCCGCAGTT-3’，反应体系如上。

6.实验结束后软件将自动进行数据分析，调整基线，计算出threshold。

实验注意事项

1.当使用二次结构较强的模板RNA时，在进行cDNA合成反应之前，将RNA溶液于65℃加热5 min后迅速置于冰中，可利用这种方法来减弱二次结构的影响，提高逆转录的效率。

2.逆转录后的产物放置于-20℃保存，但要注意不能反复冻融。4℃也可保存，约20 d。

3.在逆转录时，应有足够数量的RNA。

思考题与作业

1.实时荧光定量PCR的技术检测模式有哪些类型，各有什么优缺点?

2.管家基因做阳性对照的目的是什么？

参考文献

吴秀山.现代发育生物学实验指导[M].北京：化学工业出版社，2007.

Lee H,Suh,S S,Park E.et al.The AGAMOUS-LIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J].Genes & Development,2000,14：2366-2376.

Searle I,He Y i,Turck F,et al.The transcription factor FLC confers a flowering response to vernalization by repressing meristem competence and systemic signaling in Arabidopsis[J].Genes & Development,2006,20：898-912.

（李巧峡）