实验目的

1.能利用RT-PCR技术分析植物花发育中某些基因在RNA水平的表达情况。

2.掌握从植物组织中提取总RNA的不同方法。

3.掌握RT-PCR的实验原理与方法。

实验原理

逆转录聚合酶链式反应RT-PCR是一种简单、能快速分析基因表达情况的实验方法，尤其是在可获得的mRNA数量有限和基因表达水平很低时即可用RT-PCR来分析。因此利用RT-PCR定量的方法可研究开花诱导基因及与花发育相关基因的表达情况。RT-PCR的过程为：先提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用oligo-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下生成cDNA，再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。RT-PCR方法具有很多优点：需要的样品量少；不需使用放射性同位素；灵敏性高，是观察少量转录产物和克隆5'端区域的好方法；简单且效率高。但这种方法也存在着与PCR相关的一些潜在的问题：导致假阳性或假阴性产物，形成引物二聚体，PCR反应体系误差等。

开花是有花植物生活史中一个重大转折点，是植物由营养生长转入生殖生长最明显的标志。开花可分为开花决定或成花诱导、花的发端和花器官的形成等过程。植物开花的启动代表了植物生活周期的一个重要转换。这个转换受到环境、生理和基因表达的调控。在模式植物拟南芥中，人们已经分离鉴定了许多参与开花的基因。拟南芥有4个开花途径：光周期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径，这些途径基本都汇聚于调控基因LFY（LEAFY）、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）、FT（FLOWERING LOCUS T）的表达上。对于光周期途径，长日照下，CO（CONSTANS）蛋白积累，促进FT的转录，然后FT与含有bZIP的FD（FLOWERING D）转录因子形成异质二聚体，促进LFY基因表达。在光周期途径中，SOC1也能被CO和FT的过表达激活。在春化途径中，春化前，FRI（FRIGIDA）促进FLC（FLOWERING LOCUS C）的表达，而FLC抑制SOC1和FT表达。春化作用后，FLC的表达下降，减轻了叶与分生组织中关键调节基因的抑制，从而促进开花。在赤霉素开花途径中，外源GAs在短日照下能促进拟南芥顶芽中LFY的表达，GAs或直接促进LFY的表达，或通过SOC1上调LFY，LFY又促进AP1（APETALA1）基因表达。因此，鉴于LFY和SOC1在这几个开花途径中都有重叠与交叉，我们就有理由假定GAs与内源因子（其他激素）和外源信号（光和温度）的结合可以影响花序与花分生组织中细胞命运的生物转换。人们把拟南芥的花器官分为4轮。每一轮的花器官由特定的转录因子组合决定，这些转录因子由MADS-box基因编码。MADS-box基因在被子植物中是保守的，它们控制着花器官的特征模式。拟南芥萼片的发育由AP1和AP2（APELATA2）调控；花瓣和雄蕊的发育由AP3（APETALA3）和PI（PISTILLATA）调控；雌蕊的发育由AG（AGAMOUS）调控。

实验用品

1.材料：拟南芥不同发育阶段的花芽以及相应时期的嫩叶。

2.器材：超净工作台，PCR仪，电泳仪，冷冻离心机，EP离心管，恒温水浴锅，高压灭菌锅，枪头，烧杯，量筒，移液枪，研钵，三角瓶等。

3.试剂：oligo（dT）15，dNTP，M-MLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，MgCl2，Taq DNA聚合酶，随机引物，氯仿，乙醇，异丙酮等，实验试剂盒、琼脂糖等。

（1）异硫氰酸胍变性缓冲液：4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0），0.5%十二烷基肌氨酸钠，各组分混合，65℃用无RNase蒸馏水搅拌溶解，室温可保存3个月。

（2）RNA抽提缓冲液：异硫氰酸胍变性缓冲液20 mL，β-巯基乙醇0.144 mL，2 mol/L醋酸钠（pH 4.0）2 mL，水饱和酚22 mL。混合、完全溶解、避光，于4℃保存备用。

（3）TRIZOL RNA抽提试剂。

（4）0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）：吸取1 mL DEPC水放于容量瓶中，加双蒸水定容至1000 mL，充分振荡混匀备用。

（5）电泳缓冲液（10×TBE，pH 8.3）：Tris 108 g，硼酸55 g，Na2EDTA·H2O 7.44 g，加蒸馏水至1000 mL。使用时，将10×TBE稀释10倍使用。

（6）6×上样缓冲液（4℃保存）：0.15%溴酚蓝，0.15%二甲苯青FF，5 mmol/L EDTA（pH 8.0），50%甘油3 mL，双蒸水至10 mL。

（7）1.0%琼脂糖凝胶的配置：1.0 g琼脂糖置于100 mL电泳缓冲液中，微波炉加热至沸腾，熔化的琼脂糖冷却至60℃时，加入10 mg/mL溴化乙锭2.5 μL，充分混匀，将温热的凝胶倒入已插好梳子的电泳槽中，在室温放置30～45 min，后进行电泳。

（8）10×逆转录酶缓冲液：500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）,15 mmol/L MgCl2。

（9）10×PCR缓冲液：500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0），15 mmol/L MgCl2，1% Triton X-100。

实验程序

1.总RNA的提取

（1）异硫氰酸胍法。

①取新鲜的拟南芥不同发育时期的花芽0.1～0.2 g置于冰浴的研钵中，加入预冷的RNA抽提缓冲液2 mL，冰浴条件下充分研碎组织，并将匀浆吸入离心管中。

②每2 mL的匀浆液加入200 μL氯仿，充分混匀，冰浴15 min。

③裂解物在4℃，离心12 000 r/min，20 min。

④移取上层水相至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃下静置1 h以上，沉淀RNA。

⑤4℃，离心12 000 r/min，15 min，收集沉淀。

⑥弃去上清液，加入70%乙醇400 μL，洗涤RNA沉淀物，如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃，离心12 000 r/min，10 min。

⑦弃去上清液，自然干燥。

⑧加入100 μL无RNase蒸馏水重悬RNA，-70℃保存。

（2）TRIZOL试剂提取RNA。

①取新鲜的拟南芥放于研钵中（180 °C左右烘烤过），用液氮将花芽充分研磨约5 min，迅速加入1 mL Trizol（TianGEN），用研锤搅拌至充分混匀，用RNase-free的枪头吸入2 mL RNase-free的离心管中，室温静置10 min。

②4 °C，12 000 r/min，离心10 min，吸取上清（500 μL）于另一个1.5 mL RNase-free的离心管中，并加入200 μL的三氯甲烷，充分摇匀，室温放置3min。

③4 °C，12 000 r/min，离心10 min，将水相（200 μL）小心地吸至另一新的RNasefree的离心管。

④向水相中加等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置20 min。

⑤4 °C，12 000 r/min，离心10 min，弃上清。

⑥75%乙醇洗涤沉淀2次，4 °C，12 000 r/min，离心3 min，弃上清，室温干燥3～5 min。

⑦加入适量的DEPC-H2O溶解沉淀。

⑧电泳检测总RNA的质量，保存于-70 °C。真核生物中，若28S∶18S大概等于2∶1时，则提取的RNA质量比较好。

2.RNA检测

（1）在紫外分光光度计上检测RNA浓度和纯度。

用DEPC处理水校正零点，用DEPC处理水稀释RNA样品，读取OD260、OD280值，及OD260/OD280的比值。(www.daowen.com)

（2）琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测。

①1%琼脂糖凝胶的制备。

②制备样品。在离心管中，将RNA样品与上样缓冲液以5∶1混匀。

③一般以稳压状态进行电泳，100 V左右，电泳1 h左右。

④在凝胶成像系统观察并检测RNA的完整性，如果有28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。合格的RNA溶于75%乙醇中于-80℃保存备用。

3.cDNA合成

（1）以oligo（dT）15寡聚核苷酸为引物。

（2）用DEPC处理水将RNA稀释到0.1 μg/μL，在冰上保存。

（3）建立cDNA合成系统（逆转录反应）：2 μL oligo（dT）15（0.05 μg/μL），0.5 μg RNA，4 μL 5×逆转录酶缓冲液，1 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL M-MLV逆转录酶（200 U/μL），0.5 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL），DEPC水溶液加到总体积20 μL。轻柔搅拌混匀。室温放置10 min后，移至42℃恒温水浴锅内，反应1 h。通过在95℃放置5 min，破坏M-MLV逆转录酶活性。

（4）立即使用PCR进行扩增或在-20℃保存。

4.PCR反应

（1）为了保证实验的准确性，以及减少实验误差，所有的PCR应该在同一个PCR仪中进行。

（2）引物合成：选择拟南芥花发育过程中研究得比较清楚的基因（LFY、SOC1和FT，AP1、AP2、AP3、PI和AG）作为RT-PCR分析的对象，上下游特异引物根据Genebank中基因的序列去设计。

（3）以管家基因β-tubulin(TUB2)为定量对照基因。β-tubulin(TUB2)的上下引物为：5’-CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3’和5’-TCACCT TCTTCATCCGCAGTT-3’。

（4）PCR反应物，每20 μL含：2 μL 10×PCR反应缓冲液，0.1 μL Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.2 μL dNTP（10 mmol/L），0.4 μL上游引物（10 pmol/μL），0.4 μL下游引物（10 pmol/μL），1 μL cDNA模板，加14.7 μL DEPC水溶液到总体积20 μL。

（5）PCR反应程序：94℃预变性5 min；随后以3步（94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min）扩增DNA，共30个循环；随后72℃延伸10 min，4℃保存。

5.凝胶电泳鉴定

（1）将5 μL的PCR产物和1～2 μL上样缓冲液混合。

（2）点入配好的1%琼脂糖胶中，120 V电泳，跑胶到蓝色缓冲液接近底部。

（3）在凝胶成像系统观察并进行数据分析。

实验注意事项

1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase环境下进行，必须戴手套、口罩、使用无RNase污染的试剂、材料和容器。

2.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNA的浓度。单链RNA（ssRNA）=40×（OD260-OD310）×稀释倍数。纯RNA OD260/OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7，说明有蛋白质等污染，应用酚/氯仿继续抽提。若比值高于2.0，表明有盐、胍、糖可用LiCl选择沉淀RNA以除去杂质。

3.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当，或污染了RNase。28S和18SRNA比值为2∶1，表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。

4.RNA在75%乙醇中，2～8℃至少可以保存1周，-20℃至少可保存1年。

5.M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶等-20℃保存，操作时置于冰上。

6.dNTP保存4℃即可，勿反复冻融。

7.如果200 μL的EP管在PCR过程中盖子容易炸开，解决方法有：①用封口膜将管口密封；②最后每管加入液体石蜡进行液封。

思考题与作业

1.简述RT-PCR的实验原理。

2.利用RT-PCR技术分析拟南芥开花诱导中LFY基因的表达情况时，如何设计定量游引物？

参考文献

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（李巧峡）