实验目的

1.掌握Southern-blot技术的原理。

2.熟悉Southern-blot技术的实验方法。

3.理解Southern-blot技术能解决的科学问题。

实验原理

Southern-blot技术是1975年爱丁堡大学的Southern首创的，Southern-blot技术因此而得名。Southern-blot技术是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。DNA经限制性内切酶酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离后，使DNA在原位发生变性（双链变为单链），并将单链原位转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜的固相支持物上，经干烤或紫外灯照射固定。然后根据碱基互补配对的原理与经过Dig标记的探针进行杂交。经过显色等方法确定与探针互补的电泳条带的位置。该技术目前运用的领域比较广泛，可以绘制DNA分子的限制图谱、检测转基因植株的阳性转基因基因片段、确定旁系同源基因的个数等。

实验用品

1.材料

Dig标记AtPI（PISTILLATA）基因356 bp的DNA片段作为探针。

拟南芥植株。

HindⅢ，10×M缓冲液。

标准相对分子质量DNA Marker。

2.器材

电泳仪、电泳槽、尼龙膜、保鲜膜、水浴锅、杂交炉、紫外交联仪、恒温摇床、玻璃板、pH计、Whatman 3MM滤纸、抽纸、大培养皿、400 g重物等。

3.试剂

（1）2×CTAB缓冲液：

CTAB　20 g/L

NaCl　1.4 mol/L

Tris（pH 8.0）　0.1 mol/L

EDTA（pH 8.0）　20 mmol/L。

使用前加入2%（V/V）β-巯基乙醇。

（2）氯仿，异丙醇，乙醇。

（3）50×TAE缓冲液：50 mL。

Tris　12.1 g

冰醋酸　2.85 mL

EDTA（0.5 mol/L,pH 8.0）　5 mL。

（4）琼脂糖。

（5）6×DNA上样缓冲液：

溴酚蓝　0.25%

蔗糖水溶液　40%（W/V）。

（6）HCl：0.25 mol/L。

（7）NaOH：3 mol/L。

（8）Tris（pH 7.0）：2 mol/L。

（9）甲酰胺。

（10）鲑鱼精DNA：将鲑鱼精DNA置沸水浴中10 min，迅速置冰上冷却1～2 min，使DNA变性。

（11）预杂交液：

6×SSC

5×Denhard’t

SDS　0.5%（W/V）

甲酰胺　50%（V/V）

鲑鱼精DNA　100 μg/mL

双蒸水。

（12）中和液：

NaCl　1.5 mol/L

Tris　0.5 mol/L

pH 8.0。

（13）变性液：

NaCl　1.5 mol/L

NaOH　0.5 mol/L。

（14）20×SSC：

NaCl　3 mol/L

柠檬酸钠　0.3 mol/L。

（15）2×SSC：2×SSC，0.1% SDS。

（16）0.5×SSC：0.5×SSC，0.1% SDS。

（17）Maleic acid buffer：

马来酸　0.1 mol/L

NaCl　0.15 mol/L

用固体NaOH调pH至7.5。

（18）Washing buffer：

马来酸　0.1 mol/L

NaCl　0.15 mol/L

Tween-20　0.3%（V/V）

用固体NaOH调pH至7.5。

（19）10% Roche blocking solution：

Roche blocking reagent　20 g

Maleic acid bμffer　至200 mL。

（20）blocking solution：

10% Roche blocking solution　10 mL

Maleic acid buffer　100 mL。

（21）anti-digoxigenin-AP(75 mU/mL)。

（22）Antibody solution：

将2 μL anti-digoxigenin-AP溶于20 mL的blocking solution中。

（23）Detection buffer：

NaCl　0.1 mol/L(www.daowen.com)

Tris　0.1 mol/L

pH 9.5。

（24）CSPD（Roche）。

实验程序

1.DNA的提取。

（1）称取1 g植株叶片于灭过菌的研钵中，研钵中倒入液氮，快速将叶片研成粉末，装于25 mL的离心管中。

（2）加入65℃水浴锅预热的2×CTAB 5 mL，65℃水浴95 min，期间不断的振荡。

（3）加入6 mL氯仿充分混匀。

（4）4℃，离心10 000 r/min，10 min。

（5）将上清液5 mL转入新管中，加入2 mL异丙醇，-20℃下放置60 min或过夜。

（6）4℃，离心10 000 r/min，10 min。

（7）加预冷的70%乙醇5 mL，颠倒数次。

（8）4℃，离心12 000 r/min，3 min。

（9）倒掉多余乙醇，室温下风干5 min。

（10）加50 μL双蒸水溶解DNA，-20℃保存。

2.检测样品DNA的含量，样品含量至少需要1 μg。

3.DNA的琼脂糖凝胶电泳。

（1）选合适的限制性内切酶对总DNA进行过夜酶切（37℃），酶切体系为：

100 μL体系

HindⅢ（15μ/μL）　5 μL

10×M缓冲液　10 μL

基因组DNA　50 μL（至少1 μg DNA含量）

双蒸水　35 μL

（2）选用质量较好的琼脂糖制备凝胶，用1×TAE缓冲液配置7～8mm厚的琼脂糖凝胶，浓度为1%；将凝胶的一角切去以明确样品的顺序。

（3）上样。等DNA在上样孔内分布均匀后再电泳。

（4）低压进行电泳，先用20 V电压，再用60 V电压，电泳约1 h。

4.胶中DNA转膜前的变性处理。

（1）将凝胶转移浸泡到250 mL 0.25mol/L HCl中，室温，30 r/min，15 min。

（2）将凝胶浸泡到250 mL蒸馏水中，室温，30 r/min，1 min。

（3）将凝胶浸泡到250 mL变性液中，室温，30 r/min，15 min。

（4）将凝胶浸泡到250 mL蒸馏水中，室温，30 r/min，1 min。

（5）将凝胶浸泡到250 mL中和液中，室温，30 r/min，15 min；重复2次。

5.DNA转膜。

（1）提前让尼龙膜在20×SSC的缓冲液中慢慢浸湿。

（2）在电泳槽中进行操作，在电泳槽两侧凹下去的地方，将20×SSC倒入。按电泳槽尺寸剪2张Whatman 3MM滤纸，使其两端正好浸入到一半的20×SSC液体。

（3）将胶的四周用保鲜膜或剪开的一次性手套封住；将点样孔朝下放于Whatman 3 MM滤纸上（在电泳槽凸起的部分进行），然后在胶上再覆盖同样大小的尼龙膜，且膜与凝胶接触后再不能移动。尼龙膜上方再放入同样大小的2张Whatman 3MM滤纸，滤纸上方再放n张吸水纸，使其厚度达到6～8 cm。在吸水纸的上方再放一张玻璃板，玻璃板上再放1个400 g的重物。

（4）转膜需要过夜，大约10 h。

（5）将已吸附了DNA的尼龙膜从电泳槽中取出，放置在浸有10×SSC的滤纸上，有DNA的面朝上，在紫外交联仪中紫外照射2 min，然后再用蒸馏水做短暂漂洗，空气中干燥。此膜可以在4℃下长期保存。

6.预杂交。将预杂交液在杂交炉中42℃预热后，将膜放入杂交瓶中，其DNA面面向预杂交液。将杂交瓶卡在杂交炉使其慢慢转动，预杂交30 min。

7.杂交。

（1）取2 μL的Dig标记的AtPI探针（100～200 ng），沸水中煮5 min，并加入到20 mL的预杂交液中。

（2）将杂交瓶中的预杂交液倒掉后，慢慢倒入已加入杂交探针的杂交液。将杂交瓶卡在杂交炉使其慢慢转动，42℃杂交过夜。杂交时间10～20 h。

8.洗膜。

（1）第一次洗，取出膜浸泡在2×SSC，0.1% SDS，室温，90 r/min，5 min。

（2）第二次洗，2×SSC，0.1% SDS，室温，90 r/min，5 min。

（3）第三次洗，0.5×SSC，0.1% SDS，68℃，90 r/min，15 min。

（4）第四次洗，0.5×SSC，0.1% SDS，68℃，90 r/min，15 min。

（5）取出膜浸泡在20 mL Washing buffer中，室温，90 r/min，5 min。

（6）取出膜浸泡在100 mL blocking solution中，室温，90 r/min，30 min。

（7）取出膜浸泡在20 mL Antibody solution〔anti-digoxigenin-AP（75 mU/mL）1∶10000 blocking solution〕中，室温，90 r/min，30min。

（8）取出膜浸泡在100 mL Washing buffer中，室温，90 r/min，15 min，2次。

（9）取出膜浸泡在20 mL Detection buffer中，室温，90 r/min，5 min。

（10）取出膜，将膜放于保鲜膜上，在膜的正面加1 mL的CSPD，然后将保鲜膜的另一端轻轻盖下来，使药品均匀铺在膜上，等5 min后，将多余的液体挤到边上，然后放在已铺有X光片的暗盒中，使其曝光，曝光时间15～25 min。

（11）将X光片从暗盒中取出，先让其显影，待条带出现后（1 min内），再让其定影，整个过程在暗室中进行。

9.结果观察。

实验注意事项

1.上样前应检测每个样品的DNA含量，明确上样量。对于克隆片段的限制性内切酶产物，取0.1～0.5 μg,对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因，需要1～10 μg DNA。

2.上样时注意防止样品扩散出上样孔。

3.接触凝胶与尼龙膜时，戴上手套进行操作。

4.转膜前，尼龙膜应提前在20×SSC中慢慢浸湿，否则不能用。

5.操作时保持胶的完整性。

6.叠放在一起的玻璃板、滤纸、胶、尼龙膜、滤纸之间不能有气泡，膜与凝胶接触后再不能移动，因为从二者接触的一刻起，DNA已经开始转移。

7.曝光与显影必须在暗室中进行。

思考题与作业

1.Southern-blot技术能解决哪些科学问题？

2.探针在杂交前为什么需要煮沸5 min?

3.转膜时，凝胶的四周为何要用保鲜膜封好？

4.最后根据自己的实验结果进行讨论。

参考文献

魏春红,门淑珍,李毅.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京：高等教育出版社，2011.

Roche.DIG high prime DNA labeling and detection Starter kitⅡ.Version 13,2012.

Wang L,He L L,Li J,et al.Regulatory change at Physalis Organ Size 1 locus correlates to natural variation in tomatillo reproductive organ size[J].Nature Communication,2014,5：4271.

（李巧峡）