实验目的

1.观察花粉粒在柱头上开始萌发的时间。

2.观察被子植物的花粉管并掌握花粉粒的培养方法。

实验原理

花粉萌发和花粉管生长是高等植物完成有性生殖的重要环节。花粉是以部分脱水的状态从花药里释放的。当花粉落在柱头上时，它必须吸水由雄配子体的营养细胞产生一支通过雌性柱头和花柱的花粉管，将其中的两个精细胞运送到胚囊中。通过内壁的顶端延伸，花粉管不断生长，内壁首先在一个花粉萌发孔里伸出。花粉管的生长速度非常快，可达到每分钟10 μm。许多植物的花粉，离体条件下可在含有硼酸、钙、钾和蔗糖的溶液中吸水并产生花粉管。

在柱头上或在花柱上的花粉管，可用某些染色剂对花粉管进行选择染色，造成与柱头和花柱组织染色上的分化而明显分辨，利用花粉管壁胼胝质的性质用荧光技术染色效果更好。胚胎学研究中最常用的荧光染料为水溶性苯胺蓝，可与花粉管的胼胝质特异性结合，在356 nm波长的紫外光激发下呈明亮的黄绿色，而花柱和子房组织的自发弱荧光呈较暗的颜色，花粉管与花柱和子房组织反差明显极易区分，便于确定花粉管在花柱中的位置。

（一）利用苯胺蓝染色法观察柱头上花粉管的萌发情况

实验用品

1.材料：拟南芥花序。

2.器材：载玻片，盖玻片，荧光显微镜。

3.试剂：FAA固定液；0.05%（W/V）苯胺蓝水溶液；4 mol/L NaOH。

实验程序

1.人工授粉与固定：对开放的花朵进行人工授粉，并做好标记，分别在授粉后30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h对花柱进行取材，每次取20个花柱，观察花粉在柱头的萌发情况，每次取得的材料立即放入FAA固定液中进行固定。

2.染色：取出经过FAA固定的花柱，放入4 mol/L NaOH溶液中进行软化透明处理2 d，然后用0.05%的苯胺蓝溶液染色30 min以上。

3.观察：把花柱放在载玻片上通过压片法将材料压平，放到Olympus荧光显微镜下观察花粉粒在柱头的萌发情况。

（二）花粉离体培养与花粉管生长

实验用品

1.材料：拟南芥花。

2.器材：直径35 mm培养皿，微针，普通显微镜。

3.试剂：拟南芥花粉粒离体培养基配方：5 mmol/L MES（用Tris溶液配，用HCl将pH调到5.8），1 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2，0.8 mmol/L MgSO4，1.5 mmol/L硼酸，1%（W/V）琼脂，16.6%（W/V）蔗糖，3.65%（W/V）山梨醇，10 μg/mL肌醇。用双蒸水配培养基，并将其在100℃下加热2 min。(www.daowen.com)

实验程序

1.花粉的离体萌发。采用花药囊裂开的新鲜花为花粉萌发实验材料，每次取50朵花。取1.5 mL花粉萌发培养基于直径35 mm的培养皿中，用微针从花药中挑取适量的花粉洒入培养基中，立即将培养皿置于25℃光照恒温培养箱中萌发，湿度100%。培养6 h、12 h后取出培养皿在显微镜下观察。每一微室取5个视野进行计数，每个视野的花粉数在20粒以上，取其平均值。花粉萌发以花粉管长度大于或者等于萌发孔的直径作为萌发标准。

2.花粉管生长速度的测定。培养6 h和12 h后，取出花粉管在普通显微镜下观察。用显微测微尺测量花粉管的长度，每个培养皿统计30根以上，取其平均值。

实验注意事项

1.用于花粉管萌发实验的花在上午9：00～10：00取材较好。

2.在花粉离体萌发实验中，一定采用花药囊裂开的新鲜花为实验材料，因为在这个阶段花粉粒的萌发率最高。

3.取花药时，用微针从花药中挑取适量的花粉洒入培养基中。

思考题与作业

1.钙、钾和硼对花粉管的萌发与生长具有什么作用？

2.苯胺蓝染色柱头上花粉管的实验原理。

参考文献

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胡颖，赵洁.拟南芥有性生殖过程中花粉管生长及胚胎发育的形态特征[J].武汉大学学报（理学版）,2006,52(2)：241-246.

杨小冬,孙素琴,李一勤.硼缺乏导致花粉管细胞壁多糖分布的改变[J].植物学报,1999,41(11)：1169-1176.

姚成义,赵洁.钙和硼对蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的影响[J].武汉植物学研究,2004,22(1)：1-7.

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（李巧峡）