实验目的

1.了解花药花粉和胚囊发育的全过程，并能对花粉和胚囊发育的任何一个时期作出判断。

2.掌握爱氏苏木精的整体染色法。

3.掌握用涂抹法观察花粉母细胞减数分裂过程。

实验原理

植物一旦形成了花，其发育的下一步就是配子体发生。在植物中，配子产生于二倍体孢子体细胞的减数分裂，随后一个或多个单倍体细胞发生有丝分裂，产生多细胞的配子体。孢子体细胞分裂，生成一个绒毡层原始细胞和一个孢原细胞时，花药中雄配子体的形成开始启动。每一个孢原细胞（花粉母细胞）经过减数分裂，产生一个单倍体细胞的四分体。四分体由胼胝质壁联结在一起。在胼胝质酶的作用下，把四分体里的细胞释放出来，称为自由的小孢子。小孢子经历两次有丝分裂。第一次分裂是不对称的，产生一个大细胞——营养细胞和一个小细胞——生殖细胞。生殖细胞进行第二次有丝分裂，产生两个精细胞。绒毡层原始细胞的后继分裂形成绒毡层，绒毡层是排列在花药室内侧的营养物质。绒毡层的第一个重要作用是产生胼胝质酶，使小孢子从胼胝质壁中释放出来；另一个作用是给花粉提供营养物质。

雌配子体的发生部位是胚珠内，超过70%的开花植物采用蓼型胚囊的发育形式，即大孢子母细胞通过减数分裂产生4个细胞，其中3个死亡，第4个细胞形成大孢子。生存下来的大孢子经历3次有丝分裂，产生雌配子体或胚囊。典型的成熟胚囊有7个细胞组成，3个反足细胞，2个助细胞，1个中央细胞（包括2个单细胞核）和1个卵细胞。

实验用品

1.材料：拟南芥花序、花药和胚珠。

2.器材：手术刀片、载玻片、盖玻片、组织包埋机、手摇切片机、恒温培养箱。

3.试剂：

（1）爱氏苏木精：苏木精5 g，95%乙醇250 mL，冰醋酸250 mL，甘油250 mL，饱和硫酸铝钾（钾矾），约25 g，蒸馏水250 mL。配制方法：取1000 mL容量的广口瓶1个，倒入少量95%乙醇，先将苏木精加入，再加入冰醋酸，不断搅拌以加速溶解；加入甘油及其余的95%乙醇；研碎钾矾并加热，倾入盛有蒸馏水的烧杯中，再加温使钾矾完全溶解；将温热的钾矾溶液一滴滴地加入盛有苏木精染液的广口瓶中，并不断搅拌；用双层纱布蒙盖瓶口，再绑扎橡皮筋，使纱布固定。将染液瓶置暗处，并经常摇动促成熟，直到颜色由浅褐变成深红色为止。此染液最好在7～8月间配制，3～4周即可使用。如急用，加入1 g碘酸钠可立即成熟。爱氏苏木精稀释液配方：原液2份+50%乙醇1份+冰醋酸1份。

（2）醋酸洋红：将90 mL冰醋酸加入到110 mL蒸馏水中煮沸，然后将电炉移去立刻加入洋红1 g，使之迅速冷却过滤，并加醋酸铁或氢氧化铁（媒染剂）水溶液数滴，直到颜色变为葡萄酒色，注意不能将铁加太多，否则洋红会沉淀。放入棕色瓶中备用。醋酸洋红能使染色体染成深红色，细胞质染成浅红色。

（一）利用爱氏苏木精整染法观察大小孢子发生与雌雄配子发育

实验程序

1.石蜡切片的制作

每隔3～5 d对发育不同阶段的花芽进行取材，每次取8～10个花芽，观察大小孢子及雌雄配子发育过程，将花芽立即放入FAA固定液中进行固定。固定后的材料分离花药与胚珠，复水至50%乙醇，然后置于爱氏苏木精染色液中室温染色1～3 d（视材料大小而定），至材料呈紫红色，蒸馏水浸洗至无浮色；自来水浸洗至材料呈深蓝色；经系列乙醇脱水；二甲苯透明；浸蜡，37℃浸蜡处理24～48 h，纯石蜡56℃处理5～6次，每天换2次纯石蜡；石蜡包埋；切片（花药横切，胚珠纵切），厚度7～10 μm；粘片；脱蜡；封胶。

2.观察

光学显微镜下观察雌雄配子体的发生过程。(www.daowen.com)

（1）观察小孢子母细胞、二分体、四分体，小孢子。

（2）观察大孢子母细胞、大孢子、卵细胞、助细胞、反足细胞和中央细胞。

（二）利用涂抹法观察花粉母细胞减数分裂的各个时期和过程

实验程序

自拟南芥花蕾中解剖出一个花药，放在载玻片上，滴一滴醋酸洋红，用玻璃棒捣碎，盖上盖玻片在显微镜下观察花粉母细胞减数分裂的各个时期和过程。

实验注意事项

1.爱氏苏木精配好后，需经常摇动以促成熟。

2.爱氏苏木精整体染色法是先染色后制片。

思考题与作业

1.简述雄配子体的发生过程?

2.简述雌配子体的发生过程？

3.绘制拟南芥花药横切面结构与胚珠结构简附图。

参考文献

〔美〕B.B.布坎南,W.格鲁依森姆,R.L.琼斯.植物生物化学与分子生物学[M].瞿礼嘉,顾红雅,白书农，等译.北京：科学出版社,2004.

张荻.百子莲花芽分化及开花机理研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2011.

华中农学院植物教研室植物显微技术组.爱氏苏木精整体染色及番红-固绿双重染色滴染法在石蜡切片中的运用[J].植物学通报,1984,3(6)：56.

郑国锠.生物显微技术[M].北京：人民教育出版社,1978.

（李巧峡）