实验目的

1.了解糖类和蛋白质在花发育过程中的作用。

2.掌握PAS染色糖类和考马斯亮蓝染色蛋白质的实验原理。

3.熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。

实验原理

花芽分化是植物从营养生长向生殖生长转变的最初形态标志，花芽分化的调控直接影响到植物的开花坐果，而花期营养物质的积累直接影响着花芽分化的质量，作为结构物质和能量物质的碳水化合物在花芽分化中起着重要作用，它的积累与花芽分化密切相关。一些研究人员从作为机体代谢的主要能源物质：碳水化合物（细胞增殖、形态建成的生命基础物质）与含氮物质（氨基酸和蛋白质）的相互关系和代谢方向研究花芽分化机理，提出并不断修正、补充著名的“碳氮比”学说：足够的碳水化合物（尤其是淀粉）积累促进花芽分化，一定的氮素营养有利于植物体内蛋白质的合成，关系到花芽分化的多少。一般认为生殖器官的发育比营养生长需更高的能量，碳水化合物与含氮物质在成花转变中及花发育过程中起着重要的作用。

细胞化学方法是利用细胞内构成成分的化学性质或物理性质，通过化学反应来显示这些成分的方法。细胞化学方法要求在制作标本时必须最大限度地保持样品的形态结构和细胞内化学成分及酶的活性不发生改变，显示成分的化学反应必须对将被显示的化学物质有高度特异性和高度灵敏性，反应所生成的产物要在原位沉淀、显色明显、不溶、不扩散，并具有可重复性。通过细胞化学方法可对组织或细胞内成分进行定位、定性和定量研究，形成的有色终产物，可在显微镜下进行观察分析。如PAS反应利用强氧化剂使多糖产生游离的醛基，醛基和Schiff试剂结合，形成紫红色的化合物。因此在有多糖的部位，就会呈现出紫红色阳性反应。考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德华力结合而显色蛋白质，在有蛋白质的部位，呈现出蓝色的阳性反应。

实验用品

1.材料：拟南芥不同发育阶段的花芽。

2.器材：载玻片、盖玻片、染缸、包埋机、手摇切片机、光学显微镜。

3.试剂：乙醇，二甲苯，石蜡。

（1）FAA固定液配方：38%甲醛5 mL，冰醋酸5 mL，70%乙醇90 mL。

（2）高碘酸配方：0.5%（W/V），用0.3%硝酸配制。

（3）1 mol/L HCl的配制：取82.5 mL密度1.19 g/mL的浓盐酸加蒸馏水至1000 mL。

（4）Schiff试剂的配制：方法同实验一。

（5）亚硫酸水配方：取200 mL蒸馏水，加入10 mL 10%偏重亚硫酸钠水溶液和10 mL 1 mol/L HCl，三者使用前混匀。

（6）1%考马斯亮蓝R-250染色液：取1 g考马斯亮蓝R-250加入100 mL 7%（V/V）醋酸，置于60℃温箱中待完全溶解后备用。

实验程序(www.daowen.com)

对拟南芥不同发育阶段花芽（营养生长期、花诱导期、花器官分化期和花芽发育期）进行取材，并立即固定在FAA固定液中，常规石蜡切片法制片，将FAA中固定好的材料，经系列乙醇脱水，二甲苯透明后进行浸蜡、包埋处理，切片厚度7 μm（纵切）。切片经二甲苯脱蜡以后进行组织化学染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.切片经过高碘酸Schiff（PAS）处理，观察多糖类物质在细胞组织中分布情况。染色步骤为：石蜡切片溶蜡：二甲苯Ⅰ（3～5 min），二甲苯Ⅱ（3～5 min），1/2无水乙醇+1/2二甲苯（3～5 min）；复水：无水乙醇Ⅰ（2～3 min），无水乙醇Ⅱ（2～3 min），95%乙醇（2～3 min），85%乙醇（2～3 min），70%乙醇（2～3 min），蒸馏水；氧化：0.5%高碘酸中浸泡10 min，自来水洗1～2 min，蒸馏水；染色：Schiff试剂染色30 min；漂白：亚硫酸水Ⅰ（2 min），亚硫酸水Ⅱ（2 min），亚硫酸水Ⅲ（2 min），自来水清洗（5 min），蒸馏水；切片干燥后甘油胶封片。

2.切片经考马斯亮蓝R-250染色处理观察蛋白在组织中的分布情况。染色过程：石蜡切片溶蜡：二甲苯Ⅰ（3～5 min），二甲苯Ⅱ（3～5 min），1/2无水乙醇+1/2二甲苯（3～5 min）；复水：无水乙醇Ⅰ（2～3 min），无水乙醇Ⅱ（2～3 min），95%乙醇（2～3 min），85%乙醇（2～3 min），70%乙醇（2～3 min），蒸馏水；染色：7%醋酸（1～2 min），1%考马斯亮蓝R-250染色液中染色15 min，自来水清洗5 min，蒸馏水；切片干燥后甘油胶封片。

3.切片经过PAS染色后，阳性反应为紫红色；考马斯亮蓝250-R染色后，阳性反应为蓝色；实验通过颜色的有无与深浅比较营养生长期、花诱导期、花器官分化期、花芽发育期、盛花期各个时期的糖类和蛋白质含量的差异。

实验注意事项

1.Schiff试剂见光很容易被氧化转变为红色，药品应保存于棕色试剂瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。

2.细胞化学方法要求反应所生成的产物要在原位沉淀与显色，因此要保证手摇切片机的切刀要足够锋利，不然会使组织挤压到别的位置。

思考题与作业

1.PAS染色糖类、考马斯亮蓝染色蛋白质的实验原理。

2.在拟南芥花芽发育不同阶段中，糖类和蛋白质的含量有无变化？

参考文献

王金发，何炎明.细胞生物学实验教程[M].北京：科学出版社,2004.

胡适宜,徐丽云.显示环氧树脂厚切片中多糖、蛋白质和脂类的细胞化学方法[J].植物学报,1990,32(11)：841-846.

徐丽云，胡适宜.环氧树脂厚切片的染色[J].植物学通报,1986,4(12)：108-110.

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何绍兰,邓烈,李宜琴,等.促抑花处理对柑橘花芽分化期N素和氨基酸代谢的影响[J].西南农业大学学报,1995,17(6)：501-504.

（李巧峡）