实验目的

1.掌握花发育的解剖学研究方法与扫描电镜的制样方法。

2.通过观察早期花发育的解剖结构与扫描电镜图片，理解各个花器官的发生过程。

实验原理

成熟拟南芥的花有4种不同的花器官类型，排列在称为轮的4个同心圆上。最外轮由4个萼片组成，以十字排列。萼片是绿色的，形状和细胞组成上都与叶片类似。萼片里面是4个花瓣，以十字形排列，并与萼片精确地错开45°，即在每两个萼片之间都有一片花瓣。再往里一轮是6个雄蕊，它们在中平面上成对排列，或在侧平面上单个排列。每个雄蕊有一个细长的花丝，顶端有一个含有花粉的花药。中间一轮就有一个器官——雌蕊群，最上部是柱头，包被着伸长的乳头状细胞，可以促进花粉粒的萌发，柱头的正下部是花柱，花柱的中心是输送花粉的管道，可以促进花粉管向子房的定向生长。雌蕊群的主要结构是子房，由两个心皮组成，每个心皮含有两排胚珠。

拟南芥的花器官以螺环方式产生，最外面的螺环发育成花萼，往里依次是花瓣、雄蕊和雌蕊群。螺环的每一个花器官都以原基的形式在分生组织的侧面隆起。原基隆起的部位，代表着成熟花器官将要占据的位点。原基的大小也暗示了花器官最终形成的大小。

（一）拟南芥花发育的解剖学研究

实验用品

1.材料：拟南芥不同时期的花芽。

2.器材：染缸、手术刀片、载玻片、盖玻片、组织包埋机、手摇切片机、恒温培养箱、光学显微镜。

3.试剂：

（1）乙醇、二甲苯。

（2）FAA固定液：38%甲醛5 mL，冰醋酸5 ml，70%乙醇90 mL。幼嫩材料可用50%乙醇代替70%乙醇，以防止材料收缩；还可加入5 mL丙三醇以防蒸发和材料变硬。FAA固定液可兼做保存剂。

（3）粘片剂：铬矾（硫酸铬钾）0.025 g；明胶0.25 g；双蒸水50 mL。先在烧杯中加温溶解明胶，再加入铬矾。温度过高会使明胶烧糊。包被玻片时控制水浴锅中水温在70℃，如有明胶残渣过滤后使用。

（4）铁钒苏木精：

甲液（媒染剂）：硫酸铁铵（铁钒）2～4 g，蒸馏水100 mL，必须保持新鲜，最好临用前配制。

乙液（染色剂）：苏木精0.5 g，95%乙醇10 mL，重蒸馏水90 mL。将苏木精先溶于10 mL 95%乙醇中，慢慢倒入重蒸馏水中，瓶口用纱布扎紧置于有光处。约1个月后苏木精被氧化为深琥珀色即可使用。此时要将瓶盖盖好，可以放置很久。

切片先经甲液媒染，并充分水洗后才能以乙液染色，染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。

（5）DPX封片剂：邻苯二甲酸二甲酯5 mL；二甲苯35 mL；聚苯乙烯10 g。混合后不断搅拌，大约2 h后即可完全溶解。

（6）玻片清洗液：重铬酸钾100 g；蒸馏水800 mL；浓硫酸200 mL（浓度为20%左右）。

实验程序

1.玻片的清洗

将玻片先用肥皂水煮沸30 min，用自来水冲干净，泡入清洗液中1 d，夹出后用自来水冲洗2 h，蒸馏水中浸泡冲洗3次，然后在纯乙醇中浸泡1 d，用绵绸擦干净即可使用。

2.粘片

将粘片剂倒入染缸中置于70℃的恒温水浴锅中，然后将载玻片插入染缸中进行包片。

3.花芽分化石蜡切片的制作

（1）固定与脱水

取不同发育时期的拟南芥花芽放入FAA溶液中固定24 h以上，然后进行脱水，80%乙醇（5 min），95%乙醇（5 min），100%乙醇（5 min）；透明：1/2 100%乙醇+1/2二甲苯（5 min），纯二甲苯（20～40 min）；浸蜡：在37℃中逐步在二甲苯中加入固体石蜡，直到饱和为止，时间一般为24～36 h，然后在纯石蜡中56℃下处理，中间换4～5次，每天换2次；石蜡包埋。

（2）切片：于手摇切片机上切片（纵切），切片厚度为8～10 μm。

（3）展片：在展片台上进行展片，展片台温度为39℃。

（4）染色：溶蜡：二甲苯脱蜡（20～30 min）；复水：100%乙醇（5～10 min），95%乙醇（3～5 min），80%乙醇（3～5 min），70%乙醇（3～5 min），50%乙醇（3～5 min），30%乙醇（3～5 min），蒸馏水；媒染：甲液铁钒媒染剂（15～30 min），流水冲洗（5～10 min），蒸馏水过一下；染色：乙液苏木精染色剂（15～30 min），蒸馏水洗去多余染料；系列乙醇脱水；二甲苯透明；封片。

（5）观察：Olympus光学显微镜下观察并照相，观察拟南芥花芽分化及花器官分化的过程。

4.花发育进程分为6个时期

通过实验依次观察到：未分化期；花序芽分化期；小花原基分化期；萼片原基分化期；花瓣原基分化期；雄蕊原基和雌蕊原基分化期。然后雌蕊原基和雄蕊原基进一步发育，花芽分化完成。

（二）花发育的扫描电镜观察

实验用品

1.材料：拟南芥不同发育时期的花蕾。

2.器材：手术刀片、扫描电子显微镜、二氧化碳临界点干燥器。

3.药品：FAA固定液：70%乙醇∶甲醛∶冰乙酸=90∶5∶5；乙醇；乙酸异戊酯。

实验程序

1.将不同发育时期的拟南芥花序或花蕾固定于FAA固定液中。(www.daowen.com)

2.固定后，将材料转入70%、85%乙醇中处理2 h。

3.在95%乙醇中过夜。

4.在解剖镜下仔细将部分材料的花被片或雄蕊原基剥去，暴露出需观察的原基。

5.经无水乙醇、无水乙醇∶乙酸异戊酯（3∶1；2∶1；1∶1；1∶2；1∶3[V/V]）梯度溶液、乙酸异戊酯脱水，每级溶液中各停留20 min，然后除去多余的乙酸异戊酯。

6.真空CO2临界点干燥。

7.干燥后的材料用双面导电胶粘贴至铝合金台上，真空喷金镀膜、扫描电镜扫描。

8.观察照相。

9.根据David R.Smyth（1990）扫描电镜观察将拟南芥的花发育的早期分成12个可辨认的阶段：

（1）花原基开始凸起：平坦的分生组织上花原基开始凸起。持续时间为24 h。阶段末花的年龄为1 d。

（2）花原基形成：花原基出现并从分生组织上分离出来。持续时间为30 h，阶段末花的年龄为2.25 d。

（3）萼片原基产生：在花原基上凸起，出现萼片原基。持续时间为18 h，阶段末花的年龄为3 d。

（4）萼片覆盖花分生组织：萼片原基长大，并覆盖花分生组织。持续时间为18 h，阶段末花的年龄为3.75 d。

（5）花瓣雄蕊原基产生：花瓣与雄蕊原基在花原基上突起，长雄蕊与花瓣已经开始分化。持续时间为6 h，阶段末花的年龄为4 d。

（6）萼片包裹花芽：萼片明显将整个花芽包裹起来。持续时间为30 h，阶段末花的年龄为5.25 d。

（7）长雄蕊原基竖立在基部：长雄蕊原基已经收缩，出现雄蕊花丝。持续时间为24 h，阶段末花的年龄为6.25 d。

（8）在长雄蕊上出现花药室：长雄蕊上的药室明显可见。持续时间为24 h，阶段末花的年龄为7.25 d。

（9）花瓣原基竖立在基部：这个阶段所有的器官均伸长，花瓣原基变宽，并开始迅速生长。持续时间为60 h，阶段末花的年龄为9.75 d。

（10）花瓣与短雄蕊齐平：花瓣的高度已与短雄蕊齐平。持续时间为12 h，阶段末花的年龄为10.75 d。

（11）柱头出现：柱头已经在雌蕊群的顶端出现。持续时间为30 h，阶段末花的年龄为11.5 d。

（12）花瓣与长雄蕊齐平：花瓣的高度已经与长雄蕊齐平。持续时间为42 h，阶段末花的年龄为13.25 d。

实验注意事项

1.染色剂甲液与乙液在任何时候绝不能混合使用。

2.苏木精染液约1个月后经充分氧化为深琥珀色即可使用。

3.铬矾粘片剂容易掉片，切片在脱蜡时要注意时间，如时间太长，容易掉片。

4.切片展片后有时会产生孔洞。这是在温浴过程中水中产生的小气泡刺破石蜡造成的。如果将水倒进试剂瓶中，盖上瓶盖并剧烈摇动，再打开瓶盖，可避免气泡的产生，如此反复几次，就可排除水中的气泡，减少石蜡切片中的孔洞。

5.扫描电镜制样时，须扫描花芽的内部结构，因此要用玻璃针或不锈钢针在体视显微镜下挑掉外面的个别花萼与花瓣原基或雄蕊原基。

思考题与作业

1.描述不同发育时期拟南芥花芽的结构。

2.拟南芥的花器官分化顺序为哪种模式？

3.制作扫描电镜样品时，除了FAA固定液外，还有哪些固定液可以用？

参考文献

〔美〕B.B.布坎南，W.格鲁依森姆，R.L.琼斯.植物生物化学与分子生物学[M].瞿礼嘉，顾红雅，白书农，等译.北京：科学出版社,2004.

李秀珍,李学强.温度对甜樱桃花芽分化的影响研究[J].生物学通报，2011，46(5)：52-53.

史全芬，孟爱平，楚海家，等.青城细辛的花器官发生[J].武汉植物学研究，2009，27(4)：345-350.

吴海燕,苏雪,陈纹,等.海韭菜的花器官发生[J].2008，28(6)：653-656.

葛丽萍，路安民，潘开玉.马桑绣球（绣球科）的花器官发生和发育[J].植物分类学报，2003，41（3）：235-244.

郑国锠.生物显微技术[M].北京：人民教育出版社,1978.

David R.S,John L.B,Elliot M.M.Early flower development in Arabidopsis[J].The Plant Cell,1990,2：755-767.

（李巧峡）