实验目的

观察蛋白b-catenin对离体大鼠神经元树突发育的影响。

实验原理

b-catenin是wnt信号通路的重要组成成分，是包括大脑在内的生物体多个组织生长发育所必需的。磷酸钙转染是一种常用的将外源基因引入细胞中表达的方法，其中核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，从而使外源基因在细胞中表达。钙转的特点之一是共转染效率很高，本实验在体外培养的大鼠海马神经元上共转染b-catenin和GFP，利用GFP标出神经元形态，观察b-catenin过表达对树突发育的影响。

实验用品

1.材料

体外培养的大鼠海马神经元（本实验只需铺六个孔的细胞即可）。

2.器材

超净工作台、荧光显微镜、普通明场显微镜；pcDNA3.1空载体质粒。

3.试剂

磷酸钙转染试剂：2 mol/L CaCl2和2×HBS。

（1）2×HBS配方：HEPES 50 mmol/L，KCl 10 mmol/L，Dextrose 12 mmol/L，NaCl 280 mmol/L，Na2HPO4 1.5 mmol/L。调pH至7.0，定容到1 L，分装后-20℃保存。

（2）0.01 mol/L PBS配方（pH 7.2～7.4）：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4 10 mmol/L，KH2PO4 2 mmol/L，高温高压灭菌后室温保存。

（3）b-catenin质粒：将b-catenin cDNA装在哺乳动物表达载体pcDNA3.1上。

（4）GFP质粒：将绿色荧光蛋白GFP cDNA装在哺乳动物表达载体pcDNA3.1上。

（5）4%多聚甲醛：4 g多聚甲醛固体溶于100 mL 0.01 mol/L PBS中。

实验程序

1.取出待转染的质粒DNA和钙转相关试剂，放在冰上融化。

2.在超净台中取出6个1.5 mL无菌离心管,编上号，每一管按如下配比混匀试剂：

1～3#：1.9 μL CaCl2+2 μg GFP+2 μg pcDNA3.1空载质粒+ddH2O。(www.daowen.com)

4～6#：1.9 μL CaCl2+2 μg GFP+2 μg b-catenin质粒+ddH2O。

1～3#为对照组3次重复；4～6#为实验组3次重复。根据质粒浓度计算所加质粒体积。上述3种成分总体积为15 μL，可计算得到补加的ddH2O的体积。

3.在上述6个管中分别缓慢滴加15 μL 2×HBS。避光常温放置离心管30 min。

4.从培养箱中取出培养有大鼠海马神经元的培养板，做好标记，先用真空泵吸去每个孔中一半的培养基，然后对应加入转染混合试剂，将细胞放入培养箱中。

5.1～1.5 h取出细胞，在普通明场显微镜下观察，可见到细胞表面有黑色的颗粒状沉淀（磷酸钙沉淀），说明外源DNA已经转染入宿主细胞。

6.用Neurobasal培养基清洗细胞（贴壁加入培养基再吸出，反复2次），之后加入培养基，放回培养箱中培养。

7.48 h后取出细胞，加入4%多聚甲醛没过培养孔中玻片，固定20 min，接着用1×PBS洗3次，取出玻片，用中性封片剂（DPX）封片，在荧光显微镜下观察神经元形态。可以看到过表达b-catenin的实验组神经元相比对照在树突分支和长度上都有明显增加的现象(附图29-1)。

实验注意事项

1.加HBS时需缓慢滴加。

2.从培养箱取出的大鼠海马神经元培养细胞一般选择体外培养第4 d的细胞，此时的细胞转染效率较高。

思考题与作业

除了本实验提供的方法，你还可以用什么方法证明b-catenin对神经元的正常发育是必需的？请尝试写出实验方案。

附图29-1　b-catenin可以促进树突分支数目和长度的增加

A.表达GFP和空载；B.表达GFP和b-catenin

参考文献

〔美〕J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂等译.北京：科学出版社,2002.

Yu X,Malenka R C.β-catenin is critical for dendritic morphogenesis[J].Nature neuroscience,2003,6(11)：1169-1177.

（李凯，李巧峡）