实验目的

了解大鼠脑部海马区神经元分离培养过程。

实验原理

海马区是大脑皮质的一个内褶区，在侧脑室底部，两侧对称。这一区域目前认为与学习记忆相关，神经突触长时呈增强（LTP：long term potentiation是指神经元间突触连接强度出现较长时间增强的现象，是神经可塑性的一种形式）等现象在海马区神经元可以记录到。这一脑区也成为神经发育与可塑性领域关注的热点。SD大鼠是常用的实验动物，本实验通过学习大鼠海马神经元分离培养过程，让学生熟悉体外细胞培养基本操作并为今后实验提供实验材料。

实验用品

1.材料

SD大鼠（出生后24 h以内的发育时期均称为P0期）。

2.器材

解剖实验用器材（解剖显微镜、眼科手术剪、眼科弯头镊子等）、无菌圆形盖玻片、无菌培养皿。

3.试剂

浓硝酸、乙醇（无水乙醇和75%乙醇）、PDL包被液的配方、冷冻解剖液、组织消化液、Neurobasal培养基、含10% FBS（胎牛血清）的血清培养基等。

（1）PDL包被液的配方：0.1 mol/L的硼酸钠溶液将PDL冻干粉配成0.01 mg/mL PDL的溶液（PDL冻干粉可以从Sigma等公司买到）。

（2）冷冻解剖液配方：0.01 mol/L PBS：Na2HPO4 0.6 g，NaH2PO4 1.55 g，NaCl 8.77 g，加蒸馏水至1L，调pH至7.4，高温高压灭菌后，4℃保存备用。使用前移入-20℃冰箱冷冻1～2 h。

（3）消化液配方：L-Cysteine：2 mg；EDTA（pH 8.0）：50 mmol/L，100 μL；CaCl2：100 mmol/L，100 μL；NaOH：1 mol/L，30 μL；DNAse I：100 μL（注意DNAse在过滤除菌之前加入）；Papain：100 μL。用蒸馏水定容到10 mL,用0.2 μm的过滤器过滤除菌，置于4℃冰箱保存。

（4）Neurobasal培养基配方：Neurobasal：500 mL；B-27 Supplement：10 mL；Glμtamax-I：5 mL。

上述三种成分均可以从INVITROGEN等公司买到。

（5）含10% FBS的血清培养基配方：DMEM高糖培养基：45 mL（DMEM高糖培养基是普通动物细胞培养最常用的培养基，可以从Gibco等公司买到），FBS：5 mL。

实验程序

1.培养前准备工作

（1）清洗玻片：首先用浓硝酸浸泡过夜，使玻片上覆盖的有机物被充分的氧化。然后将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，放在摇床上晃动，将玻片上的硝酸残液清洗干净，然后置于双蒸水中浸泡过夜。第二天换双蒸水，在水平摇床上重洗2次，每次速度为200 r/min，去除玻片上的离子和其他杂质，最后再换用无水乙醇，清洗3次以上。洗完后的玻片可浸泡在无水乙醇中待用。

（2）包被玻片：可选用PDL包被的方法。实验前一天在培养板中每孔加约500 μL的PDL溶液，常温过夜。第二天种细胞前吸走PDL，每孔用PBS洗两遍，然后在超净台中风干。

2.SD大鼠解剖和取材

（1）取材前准备

器材准备：解剖前将解剖器材在超净台中用75%乙醇擦拭消毒，放在超净台中紫外消毒0.5 h以上。

准备冷冻解剖液：在超净台中将解剖液倒入无菌培养皿，移入-20℃冰箱冷冻1～2 h。(www.daowen.com)

准备组织消化液：将组织消化液放在超净台中待用。

准备玻片：将包被好的玻片洗净表面包被液待用。

准备Neurobasal和含10% FBS的血清培养基放在37℃温育2 h。

准备实验用动物：从动物房取出P0发育时期的SD大鼠用于实验前解剖。

（2）取材

手术前对大鼠全身消毒，用乙醇擦拭大鼠全身。在超净台中用眼科剪将大鼠头部剪开，充分暴露大脑，用手术镊将大脑挑出，置于冰冷的解剖液中。整个实验过程包括取大脑半球、拨脑膜、分离海马。

（3）消化组织，种细胞

将剥离好的海马组织放在无菌15 mL离心管中，加入组织消化液没过组织，置于37℃培养箱中一段时间（一般15～20 min即可）。吸去部分消化液，加入10 mL含10% FBS的培养基终止消化过程，然后用枪头吹打消化液10～20次打散组织。

消化完全后，将消化后的混合液1000 r/min，离心5 min，去除上清中细胞碎片，用Neurobasal培养基重悬，在培养板中每孔加入一定体积细胞重悬液。种下的细胞需要第二天换液，从每个培养孔中吸去0.5 mL左右的培养基，再重新加上0.5 mL预热过的新鲜Neurobasal培养基。重新置于二氧化碳培养箱中培养。

实验注意事项

1.包被的过程需在超净工作台中进行。

2.实验中P0发育时期的大鼠为出生后24 h内的大鼠，应该尽量选择出生时间短的大鼠。

3.在消化组织时，使用枪头吹打，组织在短时间内也很有可能消化不完全，可以使用分步消化的方法，即用枪头吹打10～20下之后静置1～2 min,将悬浮在上层清液中的已分散细胞移至一个新管中，将下层尚未消化完全的组织重复上述操作，直至完全消化。

4.重悬细胞后经常需要进行细胞计数，对于24孔板，一般铺细胞到10 000U（24孔板）。

思考题与作业

1.海马组织区的主要功能是什么？

2.分离海马组织区时，为什么最好用出生后24 h以内的大鼠为材料？

参考文献

安利国.细胞工程[M].北京：科学出版社,2009.

郑志竑,林玲.神经细胞培养理论与实践[M].北京：科学出版社,2002.

王英,车宇,苗建亭,等.新生大鼠海马神经元原代培养方法的研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2003,19(2)：197-199.

周明,聂菁,吕诚,等.一种大鼠海马神经元的原代培养方法[J].南昌大学学报(医学版),2010,50(3)：1-3.

http：//www.dxy.cn/bbs/thread/17651341#17651341

（李凯，李巧峡）