实验目的

1.通过本实验的进行，可初步了解和掌握哺乳动物的人工催产及手术取卵方法。

2.进一步熟悉哺乳动物的胚胎发育过程。

实验用品

1.材料

小白鼠。

2.器材

实体镜、显微镜、相差显微镜、中型解剖盘、解剖剪、小剪刀、普通镊子、尖头镊子、注射器、普通吸管、微吸管、培养皿、烧杯、手术杯、双凹载玻片、盖玻片。

3.试剂

孕马血清、绒毛线促性腺激素。

PBS缓冲液：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.15 g Na2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.132 g CaCl2，0.1 g MgCl2。将上述药品称好，放入试剂瓶内，加双蒸水至1000 mL摇匀，用HCl调pH到7.2～7.4即可使用，也可放入冰箱中保存备用。

实验程序

1.人工催青和超数排卵

（1）动物的性别鉴定：成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊。仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来进行区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。

（2）人工催青：性成熟的小白鼠，每只雌鼠腹腔注射5～10个单位的孕马血清，注射时间一般在下午4～5时，45～48 h后再注射5～10个单位绒毛膜促性腺激素，并将雌鼠与雄鼠以2∶1的比例合罐交配，交配后可每2～3 h观察阴道栓1次，为方便起见，每两天上午8时检查雌鼠，把有阴道栓的取出，如果在绒毛膜激素注射后45 h左右杀死有阴道栓的雌鼠，从其输卵管中冲出胚胎，这时胚胎处于2～4细胞期，也有未受精卵。

阴道栓即阴栓，是雌鼠交配后精液与阴道分泌液及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即出现。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转呈黄色，最后缩入阴道液化而消失，此过程需10多个小时，有的在24～28 h后仍可见，每日上午8～9时、下午1时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠第一天，并为胚龄的第一天。

2.卵的采集

采用外科手术法收集胚胎，乙醚麻醉，切开腹部，可分两种途径取卵。

（1）从卵巢取卵：成熟的卵泡凸出于卵巢的表面，透亮，用微吸管插入卵泡腔内，吸出成熟的卵（次级卵母细胞），置于凹玻片上或手术杯内。在放射冠与卵之间有一层透明的物质为透明带。卵呈透明状态，核与核仁十分清晰，卵黄颗粒细小，均匀分布于卵内。(www.daowen.com)

（2）从输卵管收卵：打开腹腔后，向上拨开肠道，暴露出卵巢、输卵管和子宫。用小剪刀将它们一起剪下，置于盛有PBS的手术杯中洗净，并在解剖镜下剔除脂肪和卵巢。将输卵管和子宫分离开。用小剪刀将输卵管剪成小段，然后用镊子挤出输卵管内含物，或用镊子和解剖针将输卵管壁挑开，用液体冲洗出其内含物。然后用微细吸管吸取冲洗出的输卵管内含物于凹面载玻片的凹面内，加盖玻片，也可不加，在显微镜下观察，如发现有透明圆球形的细胞群体（有的为二细胞，有的为四细胞），即为所需观察的胚泡，确定是胚胎后，可放到相差显微镜下进一步观察胚胎的结构。

如在输卵管内含物中没有找到胚泡，可以用同样的方法再检查一下子宫，看看胚泡是否已进入子宫。如果子宫内也没有找到，说明实验失败，需探讨失败的原因，如雌鼠的选择、打针所用的药量及雌鼠的阴道栓是否显著等等。

实验注意事项

1.人工催青后，每隔2～3 h注意观察雌鼠阴道栓的出现，并将有阴道栓的取出。

2.采集卵时，注意卵泡为透亮圆球形的形状。

3.取卵泡时，需注意小鼠发育不同阶段胚胎在生殖道所处的部位，以表27-1为依据。

表27-1　小鼠发育不同阶段胚胎在生殖道的部位

续表

思考题与作业

1.小鼠受精卵特点。

2.2细胞期极体处何位置？

3.观察8细胞末期分裂球的排列关系与早期有何不同？

参考文献

林丹军，尤永隆，张彦定.发育生物学实验[M].北京：科学出版社，2011.

陈秀兰，孟春玲.哺乳动物早期胚胎体外培养的研究[J].遗传，1984，6（5）：20-22.

（李巧峡，梁桂霞）