实验目的

1.掌握整体装片的方法。

2.掌握鸡胚发育过程中不同阶段胚体的结构及其特点。

实验原理

整体制片法是不经过切片而将整个微小或透明的生物体或器官封藏起来，制成整体装片的方法。此法制片操作简便，所需仪器药品简单，能够显示出动植物体或小型器官的全貌。适合于封藏单细胞藻类、菌类、蕨类的原叶体和孢子囊、高等植物的表皮、花粉粒和植物幼胚等，原生动物、蠕虫、昆虫和鸡胚等都可以用此法制片。整体制片法根据所用的脱水剂、透明剂和封藏剂不同而分为暂时制片法、半永久制片法和永久性制片法。

暂时制片法是材料不经过脱水与透明而直接放在载玻片上，再加上一滴水或甘油，盖上盖玻片即可；半永久制片法将藻类和柔软的材料固定后，以甘油为脱水剂。脱水时，将材料移入盛有大量5%的甘油溶液中，放入35～40℃的保温箱中，让水分蒸发，根据剩下的甘油溶液的浓度，再用新鲜配制的相同浓度的甘油代替，直到甘油的浓度逐渐升高至纯甘油。甘油冻胶封片，取一块2 mm大小的甘油胶冻于载玻片上，加热使其溶解，然后将材料从纯甘油中取出放在已溶解的甘油胶上，盖上盖玻片，这样的片子可以保存几年；永久性制片法一般以乙醇为脱水剂，透明剂根据封藏剂的种类选择，如透明剂为二甲苯，封藏剂一般选择中性树胶或DPX封片剂，如透明剂为叔丁醇，选叔丁醇树胶为封片剂。

实验用品

1.材料

种蛋。

2.器材

恒温培养箱，搪瓷盘子，棉花，染缸，玻璃棒，镊子，手术剪刀，培养皿，吸管，玻璃微管。

3.试剂

（1）硼砂洋红染色液的配法：2～3 g洋红倒入100 mL 4%硼砂（四硼酸钠）中，煮沸30 min，将此溶液静置3 d后用等量的70%乙醇冲淡，再置24 h后过滤。

（2）酸乙醇：99 mL 70%的乙醇加1 mL浓盐酸。

（3）0.75%生理盐水，Bouin固定液，乙醇，二甲苯。

实验程序

1.鸡胚整体装片的制备

取鸡胚放于小培养皿中，用吸管吸取Bouin固定液，先滴几滴在胚胎的中央，稍等片刻，再滴数滴至周围，至胚盘漂起后，始可大量加固定液（固定液用量为胚盘体积的30～50倍）。固定12 h；70%乙醇中1～3 h（中间换几次），洗去黄色；蒸馏水中约浸10 min；硼砂洋红染色6～12 h；在蒸馏水中略洗后，再放入70%酸乙醇1～2 h脱色分化，直到呈现鲜艳透明的红色为止；系列乙醇脱水：70%乙醇10 min，80%乙醇10 min，95%乙醇10 min，100%乙醇20 min，中间更换一次；纯乙醇和二甲苯等量混合液中10 min，二甲苯透明10 min；将胚盘移至载玻片上，再加数滴二甲苯，用DPX封片（在载玻片下放2～4根玻璃微管）。

2.实验观察

（1）孵化16～19 h，原条已伸到最大长度。原沟、原窝和原结开始形成，由于原条的伸长，明区也相应地伸长。由圆形变为梨形，梨柄的一端较暗为后端，前端可见有原沟、原窝和原结的构造。(www.daowen.com)

（2）孵化23～25 h，脊索前出现头褶，第一对体节出现（有的尚未出现），头部神经褶和神经沟开始出现（脊索两侧深色的带为神经褶，中间条状明区为神经沟）。头前出现一个稍亮的区域叫前羊膜。

（3）孵化26～29 h，约4对体节，左右神经褶在前端开始愈合，后端神经褶伸得更长、在靠尾端的胚盘暗区，开始出现深色的分散细胞团，称为血岛。

（4）孵化33～38 h，约10对体节，胚胎头端神经管形成前脑、中脑和菱脑。前脑较膨大，中脑和菱脑之间的界限不明显，前脑两侧有一对圆形突起，称为视泡。原始左右管状心脏已经开始会合，分散的血岛有些已联合成网状。血岛范围扩大到整个胚外区。原条已缩短到只留下尾部的一小段。

（5）孵化40～45 h，13～15体节，出现轻度头曲。端脑两侧的视泡与端脑之间收缩沟明显。前神经管孔在闭合中，中脑和菱脑之间也有明显的收缩沟为界限、后脑区分辨出5对神经元节。心脏向右侧弯曲，突出于胚体外，血岛已形成微血管丛并伸向脐肠系膜静脉。

（6）孵化48～53 h，胚胎的头部和颈部已转向右侧弯曲，出现了头曲和颈曲，端脑显著增大，视泡和脑界限分明。卵黄静脉与卵黄囊血管网相连接。胚体下部出现1对卵黄动脉，听窝凹陷加深。羊膜头褶的边缘已达到后脑前缘（见附图26-1）。

附图26-1　鸡胚早期发育附图

A.孵化16 h；B.孵化24 h；C.孵化26 h；D.孵化38 h；E.孵化40 h；F.孵化52 h

实验注意事项

1.用吸管洗胚盘时，注意不可将胚盘吸入吸管。

2.在70%酸乙醇中脱色分化时，必须时常放在低倍显微镜下检查，直至所有内部构造能看清楚为止。

思考题与作业

1.鸡胚的原沟、原窝和原结是如何形成的？

2.比较以上几个时间段内鸡胚发育的结构与特点。

参考文献

郑国锠.生物显微技术[M].北京：人民教育出版社，1978.

郭炳冉,李伦乙,郭新庆,等.鸡胚发育的活体动态实验在教学中的应用[J]，解剖学杂志,2011,34(3)：351-353.

（李巧峡，梁桂霞）