实验目的

1.初步了解细胞核移植实验的基本操作过程。

2.加深对细胞核移植技术的感性认识。

实验原理

通过移核操作器将供体——囊胚期胚胎细胞核移入同种或异种成熟未受精去核卵中，该移核卵经过卵裂、囊胚期、原肠期及神经胚期等胚胎发育过程，发育成为一个完整的个体。这个个体就是克隆动物。

实验用品

1.材料

（1）花背蟾蜍发育至囊胚期的胚胎。

（2）花背蟾蜍成熟未受精卵。

2.器材

双目实体显微镜、照明灯、拉针器、解剖器具、小剪刀、尖头镊子、酒精灯、消毒杯、培养皿、玻璃微细管、玻璃针、吸水纸等。

3.试剂

琼脂粉。

（1）手术液为Holtfreter液（pH 7.0）：NaCl 0.35 g，KCl 0.005 g，CaCl2 0.01 g，NaHCO3 0.02 g，双蒸水100 mL。

（2）细胞分离液：缺钙的Holtfreter液加5×10-4 mol/L乙二胺四乙酸二钠。

（3）培养液：10%的Holtfreter液。

实验程序

1.囊胚期胚胎及成熟卵的获得

经冬眠期后花背蟾蜍性成熟亲体，经人工催青使雌性亲体产卵，经人工受精获得受精卵，受精卵发育至囊胚期即为备用的供体胚胎。正在产卵的亲体，其体内（子宫内）尚未产出的卵即为成熟未受精卵，为备用的受体。

2.受体的准备

（1）摆卵：从子宫内取出卵带剪一小段放于吸水纸上，用弯头镊子逐个夹取并摆放于消毒后的培养皿底上，10～20粒，然后向皿内加入手术液。

（2）针刺：在实体显微镜下，用玻璃针在卵子动物极处，以45°，0.5 mm的深度轻轻刺激卵子一下（动作要轻、快）。

（3）挑核：针刺后15～20 min，可见卵动物极最中央处出现一圆球形小点，此即卵在完成第二成熟分裂后排出的第二极体。此时用玻璃针对准极体下方刺入卵内，并向上挑一下，此时极体下方的卵内1/2染色体随同少量卵质一同流出卵外。

（4）剥膜：挑核后，用尖头镊子将卵外胶膜慢慢剥除，直到卵子在皿底自由活动为度。(www.daowen.com)

3.供体的准备

取囊胚期胚胎一个在装有细胞分离液的小方杯内，用尖头镊子先剥除胶膜，然后剖开胚胎，并将动、植物极分开，吸取植物极部分，留用动物极部分，15 min后细胞开始在分离液中分散。

4.移核操作器的准备

将移核操作器注射系统的密封管内装满双蒸水，前端装上拉制好的玻璃微细管，然后调节手柄螺旋，使水面在微吸管内作上下移动，确保此系统既灵敏又准确。

5.手术皿的准备

手术皿为一直径6 cm大小的培养皿，皿内分别放置两块长方形玻璃片（载玻片的一半），其中一块玻片上事先涂以琼脂胶，另一块其外面包以绸布的外套，皿内装以手术液，用吸管将上述准备好的受体——即去核去膜的卵子移入皿内绸布的玻片上；同样方法将供体移入皿内涂有琼脂胶的玻片上。将准备好的手术皿放于实体显微镜载物台上备用。

6.移核

实体显微镜下手术皿内进行。通过调节操作器旋钮，使玻璃微吸管的口对准分散的囊胚细胞，调节手柄螺旋，使囊胚细胞被吸入微吸管内，使用的微吸管直径应略小于所吸的供体细胞的直径，使吸入的细胞在管腔内造成变形，然后再通过调节操作器旋钮，使微吸管的最前端插入受体卵内，再通过调节旋钮，放入管内的细胞，此时细胞膜破裂，放出细胞核于卵内。重复上述过程，连续进行移植。

7.培养

将移核后的卵用吸管移入另一培养皿内进行培养观察，培养液为10%的Holtfreter液。

实验注意事项

1.针刺动作一定要轻、快。

2.准备供体时，在装有细胞分离液的小方杯内杯底应事先涂一层琼脂胶。

思考题与作业

1.为什么供体细胞选择囊胚期的胚胎细胞？

2.克隆羊多莉与本实验过程有哪些相同之处和不同之处？

3.利用细胞核移植技术可以进行哪方面的研究工作？

参考文献

梁桂霞,司克媛,李荔,等.移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍成熟卵单性发育的研究[J].动物学报，2000,46(2)：183-189.

陈永龙,梁桂霞,毛铭廷.花背蟾蜍内胚层细胞核在核移植胚胎表达上的等能性[J].西北师范大学学报(自然科学版),1992,28(3)：51-55.

毛铭廷,梁桂霞.中华大蟾蜍和花背蟾蜍间细胞核移植后的胚胎发育[J].两栖爬行学报,1987,6(3)：21-25.

司克媛,梁桂霞,俞诗源,等.非洲爪蟾胚胎细胞核移入花背蟾蜍成熟卵后的细胞学研究[J].动物学报，2005,51(5)：924-931.

（梁桂霞）