实验目的

1.通过切片观察，了解蟾蜍胚胎早期发育过程的内部结构。

2.结合花背蟾蜍早期发育（一）（实验二十二），可进一步掌握胚胎早期发育中外部形态与内部之间的关系，从而建立起局部与整体、平面与立体、静止与发展的观念。

实验用品

1.材料

蟾蜍囊胚、原肠胚及神经胚期的早期胚胎。

2.器材

培养皿，解剖针，镊子，小纸盒，染缸，载玻片，盖玻片；组织包埋机，手摇切片机，光学显微镜。

3.试剂

（1）Bataillon固定液：10%铬酸水溶液25 mL；饱和苦味酸水溶液100 mL；冰醋酸10 mL（用前加入）。

（2）乙醇、氯仿、二甲苯、石蜡。

（3）1%氨水乙醇溶液。

（4）1%盐酸乙醇溶液。

（5）1%伊红水溶液和埃里希氏苏木精。

实验程序

1.蟾蜍早期胚胎切片的制备

（1）无尾两栖类早期胚胎的固定：蟾蜍早期胚胎置于Bataillon固定液中24 h，中间可换1次固定液；用自来水冲洗24 h，至苦味酸褪色为止；置于碘酒中数小时或24 h，中间碘酒换数次至碘酒不褪色为止；置于70%乙醇5 min；于80%乙醇中保存。

流水冲洗后，若卵胶膜未完全溶解，可用饱和次氯酸钠溶液3 mL处理1～2 min，即可溶解20～30粒卵胶膜，振荡溶解后水洗，置于70%乙醇5 min，后用80%乙醇中保存。

（2）无尾两栖类早期胚胎的包埋过程：蟾蜍早期胚胎置于80%乙醇（5 min）；95%乙醇（5 min）；100%乙醇（3 min）；1/2 100%乙醇+1/2氯仿（5 min）；100%氯仿（20～40 min）；1/2氯仿+1/2石蜡（30℃以上，3～4 h）；纯石蜡（15 min）。

（3）切片：于手摇切片机上切片，切片厚度为7～10 μm。

（4）染色：HE染色或番红固绿染色，方法同实验一或二。(www.daowen.com)

2.观察

（1）囊胚：注意囊胚细胞在体积上的差异及其分布位置上的特点。注意囊胚腔出现的位置及囊胚壁细胞的层次。

（2）原肠胚：识别出外胚层、内胚层、背唇、胚孔、卵黄栓、原肠腔和囊胚遗迹等构造，理解三胚层及原肠腔形成的主要过程。

（3）神经胚（横断面）：

早期神经胚：两侧神经褶正在愈合形成神经管，其上方的外胚层也于神经管上方互相愈合成为表皮外胚层，肠腔还很小，被许多含卵黄多的细胞充塞。

晚期神经胚：神经管已经形成呈管状，其两旁为神经褶，由于神经管的形成，神经外胚层完全与其他胚层分离；脊索中胚层也与其他中胚层分离，呈圆棒状而形成脊索；其他附近的中胚层则逐渐向腹方扩展，有的已劈开成内外两层，而形成体腔，消化管稍有扩大（见附图23-1）。

附图23-1　蟾蜍胚胎早期发育过程的内部结构

A.囊胚；B.早期原肠胚；C.晚期原肠胚；D.早期神经胚；E.晚期神经胚

实验注意事项

做石蜡切片时，包埋过程中注意将胚胎的位置放合适。

思考题与作业

1.简述原肠胚与神经胚的形成过程。

2.神经管、脊索、消化管分别由哪些胚层细胞发育而来？

参考文献

林丹军,尤永隆,张彦定.发育生物学实验[M].北京：科学出版社,2011.

郭瑞昌,冯伯森,仝允栩.花背蟾蜍（Bufo raddei）的早期发育及分期[J].兰州大学学报（自然科学版）,1982,18(4)：125-136.

李巧峡，李保中.以花背蟾蜍为材料进行发育生物学综合性实验的设计[J].四川动物,2010,29(5)：638-639.

（李巧峡，梁桂霞）