实验目的

1.掌握人工催产、人工受精的过程和操作技术。

2.了解脑垂体及LHRH类似物的催产作用。

3.加深对两栖类动物排卵机制的理解。

实验原理

卵子在卵巢内发生、发育和成熟，以及从卵巢内排放出来，都受到体内外诸多因素的调节和控制。其中主要因素之一为垂体前叶所分泌的促性腺激素（包括促滤泡激素FSH和黄体生成素LH）直接作用于卵巢，而垂体前叶分泌激素的作用又受到下丘脑下部分泌的促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone,GnRH）的控制。在两栖类动物，垂体激素的处理可以诱导已经充分生长了的卵母细胞的成熟和排放，这是早已知道的事实。以往，大多数学者是利用两栖类动物的脑垂体抽提液进行注射，促使两栖类动物怀卵的母体按时排卵，然后通过人工受精，在室内获得早期受精卵。1975年中国科学院上海生物化学研究所人工合成了促黄体生成素释放激素类似物（luteinizing-hormone releasing-hormone,LHRH）。实验证明，其具有脑垂体合成并释放促性腺激素的高效功能。现在，LHRH类似物已完全代替脑垂体成为鱼类、两栖类动物人工催产技术中常用的催产激素。

经冬眠后的性成熟亲体，人工注射LHRH类似物，或本种脑垂体均能促进雌性亲体产卵。通过人工受精，获得受精卵和发育的胚胎。从而达到摆脱依靠从自然界取材的限制，为许多科研工作奠定基础。

实验用品

1.材料

性成熟的雌雄蟾蜍。

2.器材

实体显微镜，照明灯，解剖盘，解剖器具，注射器，玻璃研磨器，剪刀，镊子，吸管，载玻片，盖玻片，表面皿，乙醇棉，玻璃盆等。

3.试剂

（1）Ringer氏液：NaCl 6.50 g，KCl 0.15 g，CaCl2 0.15 g，NaHCO3 0.10 g，蒸馏水至1000 mL。

（2）催产激素LRH-A。

（3）0.65%生理盐水。

（4）曝气的自来水。

实验程序

1.蟾蜍雌雄鉴别：雌体腹部较大，背部花斑较大而显著，无声囊。雄性有声囊，能鸣叫，背部花斑较小且不太显著。

2.脑垂体的摘取：用解剖剪自蟾蜍口腔插入，在其左右口角各深剪一刀，使上下颌分离，然后左手翻开上颌，右手用剪刀自耳后腺后缘处剪一刀，取下脑颅，然后将脑颅仰置（上颌面朝上），用剪刀一尖自枕骨孔处插入，紧贴左右两侧各剪一刀，剪线略呈“八”字形，用左手托住头部上颌，以拇指将剪开的“三角块”掀开，即可在“三角块”的靠尖端蝶窝内看到一个灰白色的组织，脑垂体即包于其内，用镊子将其挑出置载玻片上，稍滚动，将包于垂体处的脂肪及结缔组织分离，即露出一小米粒大小的粉红色或乳白色圆球形腺体，此即脑垂体，注意挑出时切勿将垂体碰破。(www.daowen.com)

垂体取出后如欲急用，可暂放表面皿内，滴一滴生理盐水保持湿润，待取够3～5个后，一起研磨，制成悬液。如当时不用，可立即放进丙酮内，使之彻底脱水，在丙酮中（中间换几次）约23 h后即可取出，放干燥处。待丙酮完全挥发后，即可放入小瓶内密封保存。

3.垂体悬浮液的制备：如果是新鲜垂体，可用镊子轻轻地将一定数量的垂体放在研磨棒的顶端，然后将研磨棒轻轻放进研磨器内，立即研磨，如果是保存的干垂体，可直接放入研磨器内，立即研磨，待垂体被研磨成糊状或粉状后，按每个亲体用3～5个垂体/3～5 mL生理盐水的用量，用0.65%生理盐水稀释、混匀，即为制备好的垂体混悬液。

4.催青：用灭菌注射器及针头，吸取垂体混悬液3～5 mL，或催产激素LRH-A按每只雌蟾蜍5～10 μg的剂量，选健壮的雌体做腹腔注射。注射后的亲体移入干净的玻璃盆内（水深1～2 mm），放到避光处，定时观察。

5.观察：在20～23℃的室温下，注射后10 h左右亲体出现瞪眼、呼吸迫促、攀登的表现，约17 h，腹部出现大幅度、缓慢的扩收动作，表明卵子已由卵巢跌落到腹腔，并由腹腔向输卵管输送，出现收腹的表征后6 h左右，母体即可产卵。从注射后到排卵总计大约24 h。

6.人工受精：精液的制备：取性成熟雌体，剖开腹部，取出精巢于表面皿内，用钝头镊子将精巢夹碎。加Ringer氏液5 mL，制成精液，取已有卵带排出的雌体，立即杀死，剖腹后，输卵管膨大部剪取出卵带一小段，放入干净的培养皿内，并使其伸展，然后用其自身的肺组织（洗去血液）蘸取精液少许，轻轻涂于卵带上表面及左右侧面，然后立即将培养皿倒置，静置10 min后，用存放的曝气自来水洗去多余的精液，然后加存放的自来水，放室温下令其发育，人工受精即告结束。

实验注意事项

1.取脑垂体时切勿将垂体碰破。

2.注射后激素的亲体应移入干净、避光的玻璃盆内（水深1～2 mm），定时观察。

3.将精液用肺组织蘸少许，轻轻涂于卵带上表面及左右侧面。

思考题与作业

1.脑垂体为什么有催产功能？

2.从腹腔直接取出的卵为裸卵，即尚未包上卵胶膜的卵，试试是否能受精，为什么？

3.依照表20-1写出蟾蜍人工催产的实验报告。

表20-1　实验报告表

参考文献

张键,林丹军.LRH类似物对常见两栖类的催产实验[J].福建师范大学学报（自然科学版）,1985,4：69-72.

林丹军,尤永隆,张彦定.发育生物学实验[M].北京：科学出版社,2011.

（李巧峡，梁桂霞）