实验目的

1.通过实验操作，了解免疫组织化学实验的原理和步骤。

2.掌握免疫组织化学在蛋白定性、定位及定量研究中的应用。

3.了解低分子量的神经丝蛋白在斑马鱼视觉组织早期发育过程中的作用。

实验原理

免疫组织化学（immunohistochemistry,IMH）又称免疫细胞化学（immunocytochemistry），是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。

神经丝蛋白在神经元轴突中的表达是为了组装成神经丝，与其他骨架蛋白一起形成骨架网络结构，对细胞起支架作用。许多实验证据表明低分子量的神经丝蛋白在视觉组织早期的正常发育和轴突损伤再生过程中起了重要的作用。有大量资料显示许多低分子量神经丝蛋白都在视觉轴突中有表达，它们的表达与轴突的生长发育有密切的关系。RT-97是一种在哺乳类中特异性识别磷酸化高、中分子量神经丝蛋白（200kDa、155kDa）的抗体。Velasco等在丁鲷鱼的研究中得出RT-97可作为一种可信的识别丁鲷鱼视觉系统内生长神经纤维的标记分子。

实验材料

1.材料

不同发育阶段斑马鱼的胚胎、出膜后幼体与成体斑马鱼。

2.器材

鱼缸、体视显微镜、镊子、手术剪刀、解剖针。

3.试剂

（1）Bouin’s液：饱和苦味酸50 mL，40%甲醛250 mL，冰醋酸50 mL。

（2）乙醇、二甲苯、石蜡。

（3）苏木精染液：同实验一。

（4）0.2%曙红水溶液（用前加2滴冰醋酸）。

（5）盐酸乙醇（50 mL 70%乙醇中加1滴盐酸）。

（6）0.01 mol/L PBS（pH 7.4）：0.2 mol/L PB 50 mL；NaCl 8.5～9.0 g；双蒸水至1000 mL。

（7）0.3% Triton X-100，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）配制。

（8）2% EDTA。

（9）孵育液：10%脱脂奶粉、10%正常马血清和0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）。

（10）抗体稀释液：5%马血清，0.3% Triton X-100，1%牛血清，0.01 mol/L PBS。

（11）一抗（1∶1500稀释兔抗RT-97）。

（12）生物素标记的二抗（1∶300稀释生物素化羊抗兔IgG）。

（13）加入1∶250辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

（14）DAB试剂盒。

（15）甲醇-双氧水：2 mL甲醇，0.45 mL 0.01 mol/L PBS，0.05 mL 30%的双氧水。

实验程序

1.取材

将鱼的头部剪掉，在冰浴上迅速用解剖针和镊子、剪刀分离出眼球，将其放入Bouin’s固定液中。取材时防止眼球损坏，保持其完整性。

2.冲洗、脱水和透明

（1）冲洗是将固定好的材料放入70%乙醇中大约1 h，之后再放入70%乙醇保存。

（2）脱水是将材料依次放入80%，90%，95%，100%（Ⅰ，Ⅱ）各级乙醇中各10～15 min。脱水的目的在于使组织中的水分完全除去，并使组织变硬。

（3）透明是将材料依次放入1/2纯乙醇+1/2二甲苯10～15 min；二甲苯（Ⅰ），二甲苯（Ⅱ）中共30 min。透明的目的在于使组织中的乙醇被透明剂所代替，使石蜡能很顺利地进入到组织中。

3.透入与包埋

（1）透入是将材料依次放入1/2二甲苯+1/2石蜡1 h；纯石蜡（Ⅰ），纯石蜡（Ⅱ）共30 min，确保在整个透入期间，一定要保持熔蜡炉的温度恒定，切忌忽高忽低。

（2）包埋就是将石蜡所浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入纸盒内，并立即透入冷水中，使它立即凝固成蜡块的过程。

4.切片与贴片

切片厚度为7 μm，使蜡带贴于已裹了明胶的载玻片上。

5.免疫组化染色

（1）切片经系列乙醇脱水后，在湿盒内，用含体积分数0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）冲洗，每次5 min，共3次。

（2）用2% EDTA修复液在室温下修复10 min，然后微波炉内煮沸修复10 min，冷却恢复至室温后，用0.01 mol/L PBS冲洗3次，共15 min。(www.daowen.com)

（3）用甲醇-双氧水室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，用0.01 mol/L PBS冲洗3次，共15 min。

（4）用含体积分数10%脱脂奶粉、体积分数10%正常马血清和体积分数0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）室温孵育1 h，封闭组织内非特异性结合位点。

（5）倾去孵育液后，勿洗，滴加一抗（1∶1500稀释兔抗RT-97），4℃孵育过夜，PBS冲洗冲洗3次，共15 min。

（6）加生物素标记的二抗（1∶300稀释生物素化羊抗兔IgG），室温孵育1.5 h，PBS冲洗冲洗3次，共15 min。

（7）加1∶250辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育2 h，PBS冲洗冲洗3次，共15 min。

（8）DAB染色5 min左右，蒸馏水冲洗，苏木精染液复染15 min，流水冲洗10 min，盐酸乙醇中过一下，蒸馏水中冲洗（换一次）1～2 min。然后，0.2%曙红水溶液中染色（过一下，依次通过70%乙醇（过一下）→80%乙醇（过一下）→90%乙醇（过一下）→95%乙醇（过一下）→纯乙醇（Ⅰ）2 min→纯乙醇（Ⅱ）2 min→1/2纯乙醇+1/2二甲苯中3 min→二甲苯（Ⅰ）3 min→二甲苯（Ⅱ）3 min，封片。阴性对照中用正常马血清代替一抗，其余步骤同上。

（9）在Olympus显微镜下观察、拍照。

6.实验观察

（1）免疫阳性判断标准

以切片对DAB染色强度为RT-97抗体免疫阳性反应强弱判断标准，DAB染色呈浅棕色为免疫反应弱阳性，DAB染色呈棕褐色为免疫反应阳性，DAB染色呈深棕色为免疫反应强阳性，DAB不着色的区域为免疫反应阴性。在对照实验中，以封闭马血清代替RT-97抗体，其他步骤与免疫阳性反应相同。在免疫阴性反应中，DAB不能使组织切片着色，呈阴性。

（2）视网膜的免疫组化染色

眼囊期：眼原基中有若干较浅的黄棕色细胞出现，呈较弱的RT-97抗体免疫反应阳性；旋转后切面眼原基阳性细胞增多，神经管中也出现部分阳性细胞（附图18-1-1、2）。

视杯期：阳性细胞主要位于即将形成神经视网膜层的眼囊内壁（附图18-1-3）。

耳石期：神经视网膜外层区域、视网膜睫状边缘带部分细胞和表皮外胚层细胞被染为深棕黄色，呈强的RT-97免疫阳性反应；部分晶状体细胞呈现较弱的阳性反应（附图18-1-4）。

眼色素出现期：视网膜色素细胞层出现黑色素颗粒，神经视网膜细胞层细胞数目增多，RT-97阳性反应细胞呈黄棕色，主要位于视网膜睫状边缘带，神经视网膜外层部分细胞呈阳性，晶状体部分细胞也呈较弱的阳性反应（附图18-1-5）。

体色素出现期：视网膜色素层色素颗粒增多，RT-97阳性反应增强，阳性反应细胞体数目增多，且主要排列在神经视网膜细胞层外层及视网膜睫状边缘带；视柄及晶状体细胞亦呈较弱的阳性反应（附图18-1-6）。

附图18-1　斑马鱼视网膜中神经丝蛋白的免疫组化染色

（未标明的→表示阳性细胞；*表示睫状边缘带CMZ）
D→V：背腹轴；OP：眼原基；NK：神经管；L：晶状体；R：视网膜；LP：晶状体板；E：外胚层；OS：视柄；IB：间脑；OC：视交叉；ON：视神经；IPL：内网层；INL：内核层；OPL：外网层；GL：节细胞层；NFL：视神经纤维层
1.眼囊期：眼原基（OP）中有若干弱的阳性细胞（→示）；2.眼囊期（旋转后的切面）：眼原基（OP）中有较多弱的阳性细胞（→示）；3.视杯期：视网膜（R）内弱阳性细胞较多（→示）；4.耳石期：视网膜（R）外层区域、视网膜睫状边缘带（CMZ）部分细胞和外胚层（E）有强的阳性反应；部分晶状体（L）细胞呈现较弱的阳性反应；5.眼色素出现期：各部位阳性细胞较前一期减少，但阳性有所增强（→示）；6.体色素出现期：阳性反应增强，视柄（OS）也出现弱阳性；7.出膜期：RT-97阳性细胞数目较前期减少，主要集中在视网膜睫状边缘带（CMZ）（→示）；8.出膜后4 d：视神经（ON，→示），视交叉（OC，→示），间脑（IB）有很强的阳性，内网层（IPL，→示）也有弱阳性；9.成体：视神经（ON）、视神经纤维层（NFL，→示）有很强的阳性反应，外网层（OPL，→示）、内网层（IPL）有弱的阳性；10.阴性对照

出膜期：视网膜色素层、外网层、外核层、内网层、内核层出现，RT-97阳性细胞数目较前期减少，主要集中在视网膜睫状边缘带，神经视网膜细胞层外层也有若干阳性细胞。视网膜其余部位未见有阳性细胞出现（附图18-1-7）。

出膜后4 d：视网膜各层结构已分化，内网层也有弱的RT-97阳性反应；视神经、视交叉及间脑呈很强的RT-97免疫阳性反应（附图18-1-8）。

成体视网膜：节细胞轴突形成的视神经纤维层和视神经呈很强的RT-97阳性，内网层与外网层有弱的RT-97阳性反应（附图18-1-9）。

实验注意项目

1.各种材料经固定和冲洗后，组织中就含有大量水分，而材料又逐渐变软，不能够直接投入石蜡中包埋，一定要经过脱水剂将水分脱干净，透明剂透明后，才能进入包埋阶段。

2.在加封闭液之前，需用甲醇-双氧水室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。

3.实验中需要有阴性对照。

思考题与作业

1.神经丝蛋白在视觉组织中有什么作用？

2.简述RT-97抗体定位斑马鱼视觉系统内中高分子量神经丝蛋白的原理。

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（王芳春，李巧峡）