实验目的

1.了解斑马鱼的视网膜的形态发生过程。

2.掌握HE染色方法。

实验原理

脊椎动物眼的发生是一个复杂的过程，经过一系列的诱导作用以及时间、空间上的协调作用从而形成一个具有精确功能的器官。同时，眼的发生对于研究神经系统发育起到重要的作用。斑马鱼是一种繁殖快，发育迅速，可在实验室内同时获得大量可比较个体的实验动物。斑马鱼因为中枢神经系统结构简单使其成为研究脊椎动物视网膜发育机制的一种重要模式。斑马鱼成体视网膜的结构与别的脊椎动物的视网膜结构相同，主要分为10层结构，由外向内依次为：色素上皮层（pigment epithelium layer，PEL）、光感受器细胞层（photoreceptor cell layer，PRL）、外界膜（outer limiting membrane，OLM）、外核层（outer nuclea layer，ONL）、外网层（outer plexiform layer，OPL）、内核层（inner nuclear layer，INL）、内网层（inner plexiform layer，IPL）、神经节细胞层（ganglion cells layer，GL）、视神经纤维层(optic nerve fibers layer，NFL)、内界膜（inner limiting membrane，ILM）。

实验材料

1.材料

不同发育阶段斑马鱼的胚胎与成体斑马鱼。

2.器材

体视显微镜、包埋机、切片机、镊子、解剖针。

3.试剂

乙醇、二甲苯、石蜡。

（1）Bouin’s固定液：饱和苦味酸50 mL，40%甲醛250 mL，冰醋酸50 mL。饱和苦味酸过滤，甲醛和冰醋酸最好在临用前加入。

（2）铬矾-明胶粘片剂：铬矾（硫酸铬钾）0.5 g，明胶5 g，双蒸水至1000 mL。先在烧杯中加热溶解明胶（温度过高会使明胶烧糊，应边加热边搅拌），再加入铬矾，包被玻片时控制水温在70℃（水浴锅），如有明显残渣，过滤后使用。

（3）苏木精染液：苏木精1 g；无水乙醇50 mL；硫酸铝钾5 g；蒸馏水50 mL；碘酸钠0.2 g；冰醋酸5 mL；甘油50 mL。配制方法：将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水。溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

（4）0.2%曙红水溶液（用前加2滴冰醋酸）。

（5）盐酸乙醇：50 mL 70%乙醇中加1滴盐酸（约0.5 mL盐酸）。

实验程序

1.石蜡切片的制作

（1）固定

视网膜按照Hisaoka的分期方法取眼囊期、视杯期、耳石形成期、眼色素出现期、体色素出现期的胚胎、出膜后幼体和成体斑马鱼眼球，每期5个标本，Bouin’s固定液固定2～4 h。

（2）脱水

将固定好的材料放入70%乙醇中大约1 h（如暂不操作放入70%乙醇保存），然后依次放入80%，90%，95%，100%（Ⅰ，Ⅱ）各级乙醇中各10～15 min。

（3）透明

将材料依次放入1/2纯乙醇+1/2二甲苯10～15 min，二甲苯（Ⅰ），二甲苯（Ⅱ）中共30 min。

（4）浸蜡

将材料依次放入1/2二甲苯+1/2石蜡1 h，纯石蜡（Ⅰ）、纯石蜡（Ⅱ）共30 min，确保在整个透入期间，一定要保持熔蜡炉的温度恒定，切忌忽高忽低。尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为准。力求在最短的时间内完成石蜡透入的过程，温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆收缩等，影响结果。

（5）包埋

将浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入纸盒内，并立即透入冷水中，使它立即凝固成蜡块的过程。(www.daowen.com)

（6）常规石蜡切片（横向切面），切片厚7 μm。斑马鱼胚胎太小，包埋时定位非常困难，要想获得早期胚胎理想的组织学切片，唯一的方法是大量包埋，大量切片。

（7）HE染色

用铬矾—明胶为粘片剂进行贴片，37℃温箱干燥过夜。

①切片依次通过二甲苯（Ⅰ），二甲苯（Ⅱ），1/2二甲苯+1/2乙醇，100%乙醇，100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，50%乙醇，蒸馏水。

②在苏木精中染色5 min，流水冲洗（约5 min）。

③盐酸乙醇中分化3～4 s，蒸馏水中冲洗（换一次）1～2 min。

④0.2%曙红水溶液中染色（过一下）。

⑤脱水：70%乙醇（过一下），80%乙醇（过一下），90%乙醇（过一下），95%乙醇（过一下），纯乙醇（Ⅰ）2 min，纯乙醇（Ⅱ）2 min。

⑥透明：1/2纯乙醇+1/2二甲苯中3 min，二甲苯（Ⅰ）3 min，二甲苯（Ⅱ）3 min。

（8）DPX树胶封片。

2.实验观察——视网膜的形态发生

神经管前端间脑两侧向外突出，形成眼原基，眼原基进一步向外突出与头部表皮外胚层开始接触，并沿腹侧开始弯曲、延伸，成扁平囊状，内外壁之间出现狭长的腔。眼原基继续沿背腹方向弯曲并侧向伸长，与神经轴平行，此方向的改变决定了即将形成的视杯及最终眼睛的方向。原来的眼原基背侧部分随弯曲伸长而成为外侧壁，紧贴表皮外胚层；而原来眼原基腹侧部分随弯曲旋转而成为内侧壁。眼原基外侧壁开始内陷，与内壁组成双层的视杯，内层为神经视网膜层，外层为色素视网膜层；紧贴于神经细胞层的头部表皮外胚层（此处为预定晶体外胚层）增厚，形成晶体板。视杯进一步内陷，晶体板也内陷为不规则圆形。神经视网膜层细胞快速增殖，色素视网膜层逐渐变薄，开始有少量色素。神经视网膜层细胞继续增多，并开始分化，在正对晶体后方的部位首先出现节细胞。视网膜进一步分化，可分辨出视神经纤维层、神经节细胞层、内网层、内核层、外网层、外核层和色素上皮层。视神经纤维在视乳突处相遇集中，经视柄（视神经）通向间脑。视网膜分化基本完成（附图17-1）。

附图17-1　斑马鱼视网膜的形态发生

D→V：背腹轴；OP：眼原基；Y：卵黄囊；L：晶状体；R：视网膜；B：脑；PE：色素层；G：节细胞；ON：视神经；IPL：内网层；INL：内核层；PRL：感光细胞层；OPL：外网层；ONL：外核层；GL：节细胞层；NFL：视神经纤维层
1.眼囊期：眼原基（OP）向外突出，形成扁平囊状；2.耳石期：眼囊内陷形成视杯，晶体板已内陷为不规则圆形；3.眼色素出现期：色素视网膜层（PE，→示）出现少量色素，神经视网膜层细胞不断增殖，晶状体发育为规则的圆形；4.体色素出现期：色素层（PE，→示）色素增多，神经视网膜细胞层细胞继续增多，并开始分化，在正对晶体后方的部位首先出现节细胞（G，→示）；5.出膜期：色素层色素较上一期增多，分化出的节细胞较多，在视乳突处视神经（ON，→示）代替视柄并延伸至间脑；6.出膜后1 d：内网层（IPL，→示）已分化；7.出膜后6 d：视网膜10层结构已基本分化（→示）；8.成体：视网膜10层结构完全分化（→示）

实验注意事项

1.浸蜡时，一定要保持熔蜡炉的温度恒定，切忌忽高忽低。尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为准。力求在最短的时间内完成石蜡透入的过程，温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆收缩等，影响结果。

2.斑马鱼胚胎太小，包埋时定位非常困难，要想获得早期胚胎理想的组织学切片，唯一的方法是大量包埋，大量切片。

思考题与作业

1.简述斑马鱼视网膜的发育模式。

2.简述斑马鱼作为模式动物的优点。

参考文献

于学慧，张世栋，张承海.发育生物学的理想动物模型——斑马鱼[J].中国实验动物研究杂志，2001，11(3)：172-175.

Hisaoka K K,Battle H I.The normal developmental stages of the zebrafish,brachydanio rerio(hamilton-buchanan)[J].Journal of morphology,1958,102(2)：311-327.

Schmitt E A,Dowling J E.Early eye morphogenesis in the Zebrafish,Brachydanio rerio[J].Journal of Comparative Neurology,1994,344：532-542.

Kimmel C B,Hatta K,Eisen J S.Genetic concrol of primary neuronal development in the zebrafish[J].Development(sμppl.).1991,2：47-57.

Eisen J.Developmental neurobiology of the zebrafish[J].Journal of Neuroscience,1991,11：311-317.

（王芳春，李巧峡）