实验目的

1.了解斑马鱼卵母细胞体外成熟技术。

2.掌握卵母细胞成熟的特点。

实验原理

卵母细胞的成熟是指生物体中卵母细胞经过第一次和第二次减数分裂，最终发育成具有受精、胚胎发育能力的生殖细胞过程，是发育过程中生殖细胞正常受精及早期胚胎的发育所必须经历的一个阶段。卵母细胞成熟过程包括两部分：胞质成熟和核成熟，两者在体内协调进行，从而完成这个过程。细胞质成熟能够促进细胞核成熟，而核成熟进程又会影响细胞质成熟，两者相互联系，相互影响。

细胞质成熟是一个复杂的过程，期间进行一系列复杂的生理生化变化，在电镜下观察完全成熟的卵母细胞，可见到在对应于极体释放部位，卵间周隙扩大，无微绒毛的区域形成、线粒体的聚集和重新分布以及皮质颗粒减少和重新分布等等。研究也发现，细胞内游离钙离子浓度在卵母细胞成熟分裂过程中会存在自发的波动，卵母细胞的细胞质成熟与这些波动密切相关。

卵母细胞核、细胞质及周围体细胞在卵母细胞的成熟过程都需要经过一系列的变化。卵母细胞中的遗传物质结构，在受精前几小时内，会发生一系列的变化，此过程称为核成熟。核成熟的过程是染色质浓缩、生发泡发生破裂以及第一极体的排出，成熟卵子的核停滞于减数分裂中的第二次减数分裂中期，卵母细胞受精以后，会刺激卵子继续分裂，最后排出第二极体。其中，第一极体的排出和生发泡破裂（GVBD）是卵母细胞核成熟在形态上的表现。卵母细胞成熟过程中，GVBD是卵母细胞在收到激素等外来信号的刺激后，细胞核破裂、核仁消失、核内外物质混合的一系列过程。GVBD发生过程中，在核膜侧，染色质开始进行扩散迁移，此时核仁变得越来越小，与此同时核膜发生皱褶，核仁逐渐消失，核膜随即发生破裂。卵母细胞开始并且回复减数分裂的标志性事件是发生GVBD。GVBD在不同动物卵母细胞中发生时间存在着很大差异，一系列卵母细胞体外培养成熟的实验发现，不同卵母需要的时间不同，如大树卵母细胞成熟需2～4 h。一般而言，我们通过GVBD的发生就可以判断卵母细胞简述分裂是否重新启动。卵母细胞核成熟的最终标志是第一极体的排放。（附图16-1）

附图16-1　斑马鱼卵母细胞成熟的过程附图示

Prophase I arrest：第一次减数分裂前期停滞；GVBD：生发泡破裂；Metaphase I：第一次减数分裂中期；1st div：第一次分裂；Metaphase I to Metaphase II transition：1st PB：第一极体；第一次减数分裂中期到第二次简述分裂中期的转换；Metaphase II arrest：第二次减数分裂中期停滞；2nd div：第二次分裂；Fertilization：受精；2nd PB：第二极体；Zygote：合子；Dividing embryo：分裂的胚胎

实验用品

1.材料

成年雌性斑马鱼。

2.器材

体视显微镜，微量移液枪，100 mm培养皿，剪刀，镊子。

3.试剂

17α，20β-双羟孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one，17α，20β-DHP），60%Leibovitz L-15培养基。

实验程序(www.daowen.com)

1.准备好实验用成年雌鱼。

2.用三卡因麻醉雌鱼，用解剖剪刀剪开腹部，用镊子小心将卵巢取出。

3.将卵巢放入盛有60% Leibovitz L-15培养基的培养皿。

4.用镊子小心分离FG期卵母细胞，收集若干后，转移入新的培养皿。

5.用L-15培养基清洗几次，在显微镜下将一些破损或不健康的卵母细胞剔除。

6.将这些FG期卵母细胞分成若干组，移入24孔板。

7.其中一部分加入10 ng/mL的DHP，一部分留作对照。

8.发生GVBD的卵母细胞卵黄会从不透明状变得透亮，每隔半小时对成熟的卵母细胞进行计数。统计GVBD率。GVBD率是指每个样本中发生GVBD的卵母细胞数比上该样本总卵母细胞数。运用SPSS或其他统计软件对所得数据进行处理。

实验注意事项

1.分离操作时应温柔，尽量避免对FG期卵母细胞的损伤。

2.分离的FG期卵母细胞，可在室温培养液中放置20 min左右，如卵母细胞不健康，可观察到形态的异常，以利于在显微镜下剔除。

思考题与作业

查阅相关资料，简述DHP催熟卵母细胞成熟的分子机制。

参考文献

Selman K.Stages of Oocyte Development in the Zebrafish,Brachydanio rerio[J].Journal of Morphology,1993,218：203-224.

（李建真）