实验目的

掌握斑马鱼卵母细胞的发育分期。

实验原理

除单细胞动物外，动物个体都是由两部分细胞组成：不同类型的生殖细胞和体细胞，它们都是由受精卵发育而成。在有性生殖中，精子和卵母细胞结合形成受精卵，最后发育成生物体。在其中卵母细胞担任着受精以及指导胚胎发育的重任，因此，卵母细胞的发育、成熟以及调控过程，多年来一直是发育生物学、生殖生物学研究的重点。

大多数脊椎动物，在胚胎期或者出生后不久卵原细胞便停止增殖，进入第一次减数分裂前期，此时称为初级卵母细胞。之后，经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期。在双线期的后期，细胞内染色质高度疏松，外包完整的核膜，称为核网期，此时细胞核又称为生发泡（germinal vesicle,GV）。生物体性成熟后，卵母细胞在促性腺激素或其他因子的作用下，才有可能恢复减数分裂，发生生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD），排出第一极体，并且发育到第二次减数分裂中期，成为一个成熟卵母细胞，此时从卵巢释放。

卵泡由卵母细胞和卵泡细胞（滤泡细胞和颗粒细胞）组成。卵泡的发育是一个连续的变化过程。1993年，Selman等人（1993）基于形态学标准和生化学方面的特征，将斑马鱼卵母细胞的发育过程分为Ⅰ～Ⅴ期，各期具有相应的特征。本研究中对卵子发生的描述和卵母细胞发育时期的划分均参照Selman（1993）的标准，以及Ge（2004）和Thomas（2010）进一步的补充和修改。大致划分情况如下：

PG期：初级生长期（primary growth stage，PG），卵母细胞（卵泡）体积小（7～140 μm），卵母细胞开始生长。

PV期：皮质泡时期（previtellogenic stage，PV），卵泡直径140～340 μm。卵母细胞体积进一步增大，卵母细胞外周的皮质区出现许多小泡。

EV期：早期卵黄增生期（early vitellogenic stage，EV），卵泡直径大致为400 μm。卵母细胞体积增加很快，在靠近细胞核附近能看到一些卵黄颗粒。

MV期：中期卵黄增生期（midvitellogenic stage，MV），卵泡直径大致为500 μm。卵母细胞继续增大，卵黄颗粒物质快速积累，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。

FG期：完全生长期（full grown stage，FG），卵泡直径大致为650 μm。由于卵黄颗粒数量和体积的增长，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞的细胞质。（附图15-1）

附图15-1　不同时期卵母细胞的形态

PG期：初级生长期；PV期：皮质泡时期；EV期：早期卵黄增生期；MV期：中期卵黄增生期；FG期：完全生长期

实验用品

1.材料

成年雌性斑马鱼，卵巢HE染色切片。

2.器材

体视显微镜，倒置显微镜，照相机，微量移液枪，100 mm培养皿，剪刀，镊子。

3.试剂(www.daowen.com)

60% Leibovitz L-15培养基。

实验程序

1.准备好实验用成年雌鱼。

2.用三卡因麻醉雌鱼，用解剖剪刀剪开腹部，用镊子小心将卵巢取出。

3.将卵巢放入盛有60% Leibovitz L-15培养基的培养皿。

4.用镊子分离不同时期的卵母细胞。

5.在体视镜下，根据卵母细胞的形态辨别其发育时期。

6.利用制备的卵巢切片，观察不同时期卵母细胞的细胞学形态变化。

实验注意事项

1.镊子分离时，应小心避免对卵母细胞的损伤。

2.PG期卵母细胞直径非常小，很难单独直接分离出来，在分离其他时期卵母细胞时，PG期有可能撒落在培养液中，可在分离其他时期卵母细胞后，直接观察PG期卵母细胞。

思考题与作业

1.描述不同发育时期卵母细胞的形态变化。

2.查阅相关资料，简述斑马鱼卵母细胞的生长主要由哪些激素或基因控制。

参考文献

Selman K.Stages of oocyte development in the Zebrafish,Brachydanio rerio[J].Journal of Morphology,1993,218：203-224.

Wang Y,Ge W.Developmental profiles of activin betaA,betaB,and follistatin expression in the zebrafish ovary：evidence for their differential roles during sexual maturation and ovulatory cycle[J].Biology of reprodμction,2004,71(6)：2056-2064.

Pang Y,Thomas P.Role of G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER,in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish[J].Developmental biology,2010,342(2)：194-206.

（李建真）