实验目的

掌握胚胎显微注射技术。

实验原理

显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术，将外源基因直接注入受精卵、胚胎细胞或体外培养的细胞中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，以研究外源基因的功能或获得转基因动物的技术。研究斑马鱼最大的优点之一就是可以迅速和便捷的研究基因功能。如Morpholinos，一个人工合成的寡核苷酸链，序列和目的基因的RNA互补，通过显微注射到胚胎后，可特异性地降低目的基因的表达量。相反，体外转录的mRNA也可通过显微注射到胚胎中，以提高目的基因在体内的表达量。显微注射高效而快速，可在1 h内注射几百枚胚胎。

实验用品

1.材料

斑马鱼。

2.器材

体视显微镜，显微注射仪，氮气罐，1 cm OD玻璃毛细管，照相机，1 mL塑料吸管，微量移液枪。

3.试剂

胚胎培养液，GFP质粒DNA。

实验程序

1.显微用针的准备、上样和准备工作

（1）利用显微拉针仪，将1 mm OD玻璃拉成2根注射用针，妥善进行保存。

（2）用微量上样器或微量上样枪头，从显微用针的底部将要注射的物质缓慢移入针内。向针头的方向晃动数次直到液体中无气泡。

（3）打开氮气罐和显微注射仪，将装有注射物质的针头插入显微注射仪的金属管中，要确保针头插紧。检查显微手动操作装置的位置，以保证注射的方便。将插好的针头放在显微镜下，调整好视野后，用尖镊子小心地修整玻璃针的头部，以使针头更锋利，更容易穿过胚胎的胶膜。

（4）利用3 cm定量毛细管测定每次注射的溶液量，将显微注射仪上的注射时间调整至秒级别，将注射针头小心地放在毛细管关口处，踩踏开关，液体将注射入毛细管中，之后用毫米级别的尺量取注射入毛细管的液体的长度，进行换算。3 cm的定量毛细管的容量为1 μL。如5 s内注射入毛细管的液体为6 mm，那么注射总量为0.2 μL，其后将显微注射仪上的注射时间调整至毫秒级别，5 ms注射量为2 nL。

2.胚胎的准备和收集

（1）在注射的前一天晚上，准备好实验用鱼。

（2）实验当天早晨，收集胚胎。

（3）将足够量的胚胎置于培养皿中准备注射，用吸管吸去多余的水分，并尽量使胚胎不要超过1细胞期。(www.daowen.com)

3.注射

（1）确保胚胎时期没有超过4细胞期，最好在1细胞期。

（2）将针头放低，用另外一只手压住装有胚胎的培养皿。

（3）将针头穿过胶膜的表面，轻轻地穿入卵黄，注意不要挑起卵黄或者使胚胎受损严重。将注射的物质注入卵黄中（附图14-1）。

（4）注射一批胚胎后，轻轻加入少量胚胎培养液，并将这些注射后的胚胎转移至干净的培养皿中。保留一部分未注射的胚胎为对照。在注射后的当晚，弃去死亡的胚胎，并对注射过的胚胎进行计数。定期更换胚胎培养液以减少因感染而引起的胚胎死亡。

（5）结果观察。

24 hpf后，于荧光显微镜下，观察注射GFP质粒DNA后胚胎所发出的绿色荧光。

附图14-1　斑马鱼显微注射

A.将斑马鱼按顺序在显微镜下摆好；B.针头插入胚胎中的显微附图示；C.注射后的胚胎

实验注意事项

1.注射时应尽量避免气泡或拉伸卵黄，这些操作都会使胚胎死亡。

2.用塑料吸管弃去未受精或在注射过程中受损的胚胎。

思考题与作业

1.统计注射后的死亡率。

2.统计发出绿色荧光的胚胎比例。

参考文献

Jochen W.Microinjection of DNA,RNA and tracer dyes into early fish embryos[J].Applications,2011,112.

（李建真）