实验目的

掌握斑马鱼早期软骨及骨的形态学变化。

实验原理

骨骼的形成与发育以及在发育中所受到的影响，在形态学、病理学、分子生物学等相关领域的研究中是必不可少的内容。鱼的骨骼由外部骨骼（牙齿、鳞）和内部骨骼（脊索、软骨、硬骨以及结缔组织）组成。软骨本来是以糖蛋白质为主要成分的组织。与此相反，所说的“硬骨”主要是由磷酸钙微晶组成的，但在生物学中把硬骨称为“骨”。在脊椎动物中，外骨骼从一开始就是骨。与此相反，内骨骼的形成则是从软骨开始的。在硬骨鱼的外骨中，鳞潜入皮下，除变成像头盔那样包住软骨头盖形状的骨之外，还有包住颚的软骨。而且内骨骼还会逐渐从软骨向硬骨转换。

软骨由软骨组织及其周围的软骨膜构成。软骨组织由软骨细胞、纤维和基质构成。在胚胎发生时期，软骨作为临时性骨骼，成为身体的支架。随着胚胎的发育，软骨逐渐被骨所代替。在成体内仍旧保留一些软骨，具有支持和保护功能。骨是由骨组织、骨膜、骨髓及关节软骨所构成。骨组织构成骨的主要成分，其特点是在间质中有大量的钙盐沉着，使之成为体内最硬的组织。体内有99%的钙是以羟基磷灰石的形式储存于骨内，因为骨成为体内最大的钙库，与磷、钙代谢有着密切关系。本实验所使用的斑马鱼软骨与骨双染色方法依据MB Walker和CB Kimmel改进之方法，Alcian Blue可与糖蛋白结合，Alizarin red可与Ca形成复合物。

实验用品

1.材料

已固定好的斑马鱼不同时期的胚胎。

2.器材

体视显微镜，照相机，1 mL塑料吸管，微量移液枪。

3.试剂

（1）无酸的双染色试剂：由两部分组成，这两部分在用前混合在一起。A部分包括用来染软骨的Alcian Blue 8 GX染料，B部分包括用来染骨的Alizarin red S燃料。A部分最终浓度为0.02% Alcian Blue，40 mmol/L MgCl2和70%的乙醇。因为Alcian Blue不易溶解于70%乙醇中，一般将粉末溶解入小份的50%乙醇中，在37℃中孵育，混合后即可溶解，之后加入95%的乙醇和水调整至终浓度。100 mL的A部分可由5 mL 70%乙醇（含有0.4% Alcian Blue），70 mL 95%乙醇，MgCl2和水混合而得。B部分是由0.5% Alizarin red S粉末溶于水而得。A部分和B部分试剂可在室温中保存数月至1年。双染色试剂由10 μL的B部分和1 mL的A部分在即用前混合制得。

（2）蛋白酶消化液：0.1 g胰蛋白酶，2 mL四饱和硼酸钠，7 mL双蒸水以及一滴（约0.1 mL）过氧化氢（1% H2O2）。

（3）不同浓度的乙醇，蒸馏水。

实验程序

1.胚胎发生4～7 d后的幼鱼用tricaine麻醉后，收集50条左右，转移至1.5 mL EP管中，弃去胚胎培养液。

2.加入1 mL 4% PFA固定，室温摇动2 h或4℃过夜。(www.daowen.com)

3.弃去固定液，加入1 mL 50%乙醇，室温摇动10 min。

4.弃去50%乙醇，加入1 mL双染色试剂，室温摇动过夜。

5.胚胎漂白。漂白的试剂在用前混合（等体积的3% H2O2和2% KOH混合后的到终浓度为1.5% H2O2和1% KOH的混合液）。弃去染色液，加入1 mL水，颠倒EP管数次，弃去水。加入1 mL漂白液，开盖，置于室温20 min。

6.弃去漂白液，加入1 mL含有20%甘油和0.25% KOH的溶液，室温摇动30 min至过夜。

7.弃去上步溶液，加入1 mL含有50%甘油和0.25% KOH的溶液，室温摇动2 h至过夜。

8.结果可在显微镜下观察。

实验注意事项

1.以上所示的溶液量为大致量，可以加至1.0～1.5 mL。

2.操作时应该小心避免对幼鱼的损伤，幼鱼很容易粘在管壁或枪头上，因此在换液操作时应该轻柔。

思考题与作业

1.双染色的结果附图。标明所染软骨和骨的结构名称。

2.查阅相关资料，简述斑马鱼软骨和骨的早期发育过程。

参考文献

Walker M B,Kimmel C B.A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae[J].Biotechnic & Histochemistry,2007,82(1)：23-28.

（李建真）