实验目的

掌握如何制备组织切片的技术。

实验原理

组织切片技术应用非常广泛，是观察组织器官细胞形态变化的主要手段，包括冰冻切片及石蜡切片。其中石蜡切片的优点是组织结构保存良好，在对结构分辨率要求较高和回顾性研究中有较大的使用价值，能进行连续切片，组织结构清晰。石蜡切片法大致的流程包括固定、包埋、切片、染色、脱水和封片等步骤。关键是把生物材料用石蜡包埋，以石蜡为支持物，把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片。操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度乙醇脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度乙醇复水→染色→逐级从低浓度到高浓度乙醇脱水→二甲苯透明→树脂胶封片。

实验用品

1.材料

收集受精后60 h斑马鱼胚胎。

2.器材

体视显微镜，照相机，1 mL塑料吸管，微量移液枪。

3.试剂

PBS，二甲苯，梯度乙醇，苏木精，伊红，石蜡。

实验程序

1.取材与固定

收集受精后60 h斑马鱼胚胎（一部分胚胎尚未孵化，用眼科镊子或大头针将卵膜剥开）放入4% PFA中，之后置于4℃中过夜。

2.透水及透明

在室温状态下进行，主要组织的充分脱水，否则包埋后出现透明感欠佳，会出现一部分组织的白浊现象以及组织的收缩硬化。

（1）PBS 2次，每次30 min。

（2）70%乙醇，15 min。

（3）80%乙醇，15 min。

（4）90%乙醇，2次，每次15 min。

（5）100%乙醇，2次，每次15 min。

（6）二甲苯，2次，每次15 min。

（7）石蜡，3次，60℃，每次20 min。

3.包埋及切片

使用石蜡包埋机进行常规包埋，继而用切片机切片，厚度为4 μm。

4.HE染色与封片

可按下列条件进行脱蜡、水化、HE染色、脱水、透明：

（1）二甲苯，2次，每次15 min。(www.daowen.com)

（2）100%乙醇，5 min。

（3）95%乙醇，5 min。

（4）90%乙醇，5 min。

（5）80%乙醇，5 min。

（6）70%乙醇，5 min。

（7）蒸馏水，3 min。

（8）苏木精，5 min。

（9）流水，2 min。

（10）盐酸乙醇，10 s。

（11）流水，40 min。

（12）蒸馏水，3 min。

（13）伊红，4 min。

（14）80%乙醇，2 min。

（15）90%乙醇，3 min。

（16）95%乙醇，2 min。

（17）100%乙醇，2次，每次3 min。

（18）二甲苯，2次，每次5 min。

（19）利用中性树胶进行常规封片。

实验注意事项

1.每次染片前，必须将苏木精和伊红过滤，将沉淀物和杂质除去。

2.二甲苯、乙醇尽可能新鲜，特别是伊红后的80%、90%乙醇必须是新鲜配制，否则影响切片的清晰度。

思考题与作业

1.显微拍摄的染色结果附图。

2.查阅相关资料，了解除HE染色外，还有其他那些染色方法，并简述其特点。

参考文献

袁广明，胡黎平，李燕，等.成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色[J].解剖学研究，2006，28(1)：73-75.

（李建真）