实验目的

掌握斑马鱼RNA的提取及cDNA的制备方法。

实验原理

RNA原位杂交（RNA in situ hybridization，RISH）是运用cRNA（complementary RNA probe）或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。与mRNA同序列的同义RNA探针（sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisense probe），即互补RNA探针。在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体（Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交的优点：①RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。②RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。③在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。

本实验采用地高辛标记的探针是鉴于这种探针的一些优点。与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰、敏感性高、分辨率高、反应产物颜色鲜艳、反差好、背景染色低以及制备探针可较长期保存。整体原位杂交是一种检测胚胎发育过程中基因表达的快速、有效的手段，能够直观地观察到基因在整体胚胎中的时空表达位置。

由于斑马鱼胚胎完全透明，在胚胎发育早期即3 dpf（day post-fertilization）之前，杂交信号不论是在胚胎的表面或是在胚胎的深层组织中，都很容易显现出来，这样就可以通过整体原位杂交获得较好的斑马鱼胚胎的杂交信号。

实验用品

1.材料

固定好的斑马鱼不同时期的胚胎。

2.器材

体视显微镜，微量移液枪。

3.试剂

（1）PBS：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，DEPC-H2O至1 L。HCl调pH至7.4，灭菌。

（2）4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g，PBS 1 L。加热持续搅拌至溶液澄清（60℃，水浴锅加热）。-20℃保存。

（3）PBST：PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

（4）20×SSC：C6H5O7Na3·2H2O 88.2 g，NaCl 175.5 g，DEPC-H2O至1 L，灭菌。

（5）SSCT：SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

（6）HYB-：用甲酰胺∶20×SSC储液∶DEPC-H2O=2∶1∶1配制。加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20℃保存。

（7）HYB+：HYB-20 mL，yeast RNA 10 mg，heparin 1 mg。-20℃保存

（8）MAB：maleic acid 11.6 g，NaCl 8.8 g，用固体NaOH（约7 g）调至pH=7.5。4℃保存。

（9）MABT：MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

（10）10% blocking reagent：blocking reagent 8 g，MAB 72 mL。

（11）MABT+blocking reagent溶液：灭活羊血清∶10% BM blocking reagent∶MABT=1∶2∶7。用时现配。

（12）Staining buffer：Tris 12.1 g，pH 9.5，MgCl2·6H2O 10.2 g，NaCl 5.85 g，Tween-20 1 mL。用之前加1 mol/L的左旋咪唑储液，使之终浓度为1 mmol/L。

实验程序

1.原位杂交第一天

（1）重新水化和固定

①吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5 min。

②置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5 min。

③置换成PBST溶液，放置5 min，重复1次。

④置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20 min。

⑤用PBST洗2次，每次放置5 min，室温。

（2）蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

①用10 μL/mL的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24 h的胚胎处理3 min，24 h以上的胚胎处理5 min或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

②用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5 min。

③用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20 min，室温。

④用PBST洗2次，每次放置5 min，室温。(www.daowen.com)

（3）预杂交

①每个管中置换成大约300 μL HYB－溶液，60℃水浴5 min，避免振荡。

②用等体积的HYB+取代HYB－。

③60℃水浴，预杂交4 h以上。

（4）杂交

①吸去预杂交的HYB+，加上100 μL已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/μL）。

②60℃温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55～60℃不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

2.原位杂交第二天

（1）将探针回收，放于-20℃保存(通常探针可重复使用10次左右)。

（2）加入50%甲酰胺/2×SSCT溶液1 mL，60℃，放置30 min，重复1次。

（3）置换2×SSCT 1 mL，60℃，放置15 min。

（4）置换0.2×SSCT 1 mL，60℃，放置30 min，重复1次。

（5）用MABT洗2次，每次5 min，放在摇床轻轻摇动。

（6）室温下加1 mL 1∶2∶7溶液，时间为1 h。

（7）按1∶3000的比例在1∶2∶7溶液中加入酶连地高辛抗体，4℃冰箱过夜。

3.原位杂交第三天

（1）用1 mL含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25 min；然后用1 mL MABT置换，25 min；再用1 mL MABT溶液置换，1 h以上；最后用1 mL MABT溶液置换，25 min。

（2）用1 mL 1 mmol/L左旋咪唑的Staining buffer洗3次，每次放置5 min。

（3）将胚胎转入16孔板中，吸去staining buffer，加上300 μL BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5 mmol/L左旋咪唑），16孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

（4）每隔1 h观察胚胎是否开始显色。

（5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。

（6）4℃冰箱保存。

实验注意事项

1.实验成功的关键在于探针的标记是否成功。

2.在实验操作过程中，特别是对较早期的胚胎进行杂交时，换液时一定要轻柔，以避免损伤胚胎。

3.整个实验过程中，只有在PBST可以放置超过以上步骤中规定的时间，其他都需要严格遵守步骤中的时间。

4.显色过程中，应不断检查显色效果，以避免显色过度。

思考题与作业

1.使用显微照相机拍摄原位杂交结果。

2.原位杂交实验过程需要注意哪些事项？

3.在选取进行原位杂交探针序列时需要注意哪些事项？

参考文献

Christine T,Bernard T.High-resolution in situ hybridization to whole-moμnt zebrafish embryos[J].Nature Protocols,2008,3：59-69.

（李建真）