实验目的

掌握如何对斑马鱼目的基因片段的PCR扩增方法。

实验原理

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种选择性体外扩增DNA的方法。它包括三个基本步骤：①变性（Denature）。目的双链DNA片段在94℃下解链。②退火（Anneal）。两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对。③延伸（Extension）。在Taq DNA聚合酶扩增DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经过合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经过数轮循环后就可使DNA扩增达数百倍。

PCR反应中的主要成分包括：

1.引物

寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置以及扩增区域的Tm值。好的引物设计可避免背景和非特异产物的产生。引物设计也极大地影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；使用正确设计的引物得到的产量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度、模板浓度等。计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。引物的设计目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。如果PCR的退火温度设置近于引物的Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18～24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。引物的二级结构，包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等，都会影响引物和模板的结合，从而影响引物效率。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值在56～62℃范围内。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。

2.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）

一般反应中每种dNTP的中浓度为20～200 μmol/L。dNTP终浓度大于20 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。

3.Mg2+

Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5～2 mmol/L。

4.模板

PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

5.Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130 min，95℃40 min，97℃5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下可维持更长时间。各种商品化Taq DNA聚合酶都有自己特定的一些缓冲液。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，渗入10 nmol/L dNTP到核算中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率高，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100 μL PCR反应中，1.2～2 U的Taq DNA聚合酶就可以足以进行30轮以上的循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。

实验用品

1.材料

制备好的斑马鱼cDNA或基因组DNA。

2.器材

微量移液枪。

3.试剂

Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC-H2O配制）、DEPC处理后的蒸馏水。

实验程序

用β－actin基因的引物进行PCR扩增，反应体系如下：

补加水至25 μL，按以下条件扩增：94℃，5 min，然后进行（94℃，45 s→64℃，45 s→72℃，60 s）共35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增结束后，取5 μL的PCR产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

实验注意事项

1.PCR中引物设计要合理。

2.PCR反应特异性强，引物浓度、聚合酶和dNTP的量不宜过多，如出现非特异性的扩增条带，需要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，以及Mg2+等。

3.PCR反应灵敏性较强，应极力避免污染，在加样全程应该保持注意力集中，避免枪头间的交叉污染。

思考题与作业

1.给出电泳检测PCR结果附图。

2.简述PCR过程应注意哪些事项？

参考文献

卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京：中国协和医科大学出版社,1999.

附：参考内容(www.daowen.com)

随着生物学研究和电子信息技术的飞速发展，以及研究领域内资源和数据共享理念的推广，许多实验数据资料利用数据库技术和互联网技术被集中整理、发布，形成了生物学数据库。目前针对斑马鱼存在很多数据库。此外越来越多的斑马鱼基因被研究者克隆鉴定，其命名规则也与哺乳动物有一些不同，以下一并做简要介绍。

一、斑马鱼数据库

1.ZFIN和ZIRC：斑马鱼信息网络（Zebrafish Information Networks，ZFIN；亦称斑马鱼

模式生物数据库，the Zebrafish Model Organism Database，其网络地址为http：//zfin.org）。是由首先将斑马鱼引入模式生物研究的俄勒冈大学维持的一个斑马鱼中心信息网站。ZFIN收集有以下信息：

（1）斑马鱼的所有已知基因、分子标记、各种克隆、SNP、morpholino、抗体等；

（2）斑马鱼基因型、表现型相关信息（包括大量基因表达信息的附图片）；

（3）斑马鱼基因组附图谱和作附图（Mapping）相关信息；

（4）各类斑马鱼野生型品系、突变品系、转基因品系；

（5）网站注册的斑马鱼研究机构、公司和个人信息；

（6）召开过和即将召开的有关斑马鱼研究的会议信息；

（7）斑马鱼研究相关文献的提名、作者、摘要等信息；

（8）通往其他斑马鱼相关网站、数据库、研究计划的链接。

除了收集整理各种信息之外，ZFIN同时还承担以下责任或提供以下服务：

（1）提供以上各类信息的检索服务；

（2）制定斑马鱼组织结构解剖学定义；

（3）制定斑马鱼品系、基因命名和更新规范（由斑马鱼命名委员会负责）；

（4）提供The Zebrafish Book的在线版本；

（5）收集研究者提交的新品系、基因、克隆等信息；

（6）斑马鱼研究相关新闻的更新。

国际斑马鱼资源中心（The Zebrafish International Resource Center，简称ZIRC，网址http：//zebrafish.org/zirc/home/guide.php）是同为俄勒冈大学维持的和ZFIN有着密切联系的另一个资源中心，主要是收集、维护和提供上述可获取资源，同时负责各种品系的保管、育种以及其他很多生理和病理试剂产品订购服务。

ZFIN提供了丰富的搜索模式，可以根据名称（包括旧名）、其他数据库AC索引号等检索特定基因、分子标记、各类克隆，可以通过基因名、基因型、时期、提交者、发育时期、表达部位等的全部或部分信息检索基因的原位杂交、免疫组化、Northern印迹、Southern印迹、RT-PCR等表达信息。具体使用方法可参阅网站的帮助系统。

2.ZGC：斑马鱼基因搜集计划（Zebrafish Gene Collection，ZGC，http：//zgc.nci.nih.gov/）是由美国国立卫生研究院（NIH）下属单位国立癌症研究所（NCI）发起的哺乳动物基因搜集计划（MGC）的一个附属部分，目标是获取所有全长斑马鱼基因mRNA或cDNA序列（至少是完整的编码序列）。其基本策略是从cDNA库中获取克隆中基因的5’序列，然后通过完善序列获取全长的基因，并克隆到新的载体中。

如果一个基因由ZGC计划发现，那么基因的符号将由zgc：开头，直到它被命名委员会赋予一个更合适的名字为止。此外还有其他各种斑马鱼研究计划，具体信息请参阅各自的网站。这些计划的列表可以通过ZFIN首页的“Zebrafish Programs”部分的链接获取。

二、斑马鱼基因命名规则简介

如果能确定在哺乳动物中的直系同源基因，名称和符号尽量与后者保持一致。对于斑马鱼的命名规则主要依据于1992年在德国的Ringberg举行的一次会议讨论，目前该命名规则以被大多斑马鱼实验室接受。

基因的名称应为小写斜体。基因的命名应与哺乳动物的直系同源基因保持一致。当哺乳动物的同源基因是已知的，在斑马鱼中应该使用相同的名称和缩写，但所有字母应为斜体的小写。蛋白质的简写应与基因简写相同，但不用斜体，首字母须大写。同一基因家族的成员应按顺序标记。在有些情况中，一个斑马鱼基因曾经由一个较旧的斑马鱼名称命名过，在发表文章时最好也参考之前的名称，将旧名称用括弧标注在新名称的后面。

如：shha(syu),bmp2b(swr)

和哺乳动物不同，因为辐鳍鱼在演化过程中经历了一次全基因组额外加倍事件，斑马鱼的基因组包含一些重复的片段。因此，斑马鱼经常含有一个基因的两种拷贝，在哺乳动物中往往只有一种。在这种情况里，两个斑马鱼基因拷贝的名称都应遵循已经接受的人或小鼠的同源基因的名称，并在其后加“a”或“b”以标识有两个拷贝。

如：igf2a,igf2b

一般同一基因可能拥有多个转录本，不同转录本可以在基因名后加“transcript variant”加数字，基因缩写可以在其后加“tv”加数字。

如：基因名为igf3,transcript variant 1,igf3,transcript variant 2,

可简写为：igf3_tv1,igf3_tv2

人类、小鼠和斑马鱼的基因和蛋白命名符号书写格式示例对比如下：

（李建真）