实验目的

1.掌握斑马鱼RNA的提取。

2.cDNA的制备的方法。

实验原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中，75%～85%为rRNA（主要是28S～26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。mRNA一般只占总RNA的1%左右，而且由于RNA酶（核糖核酸酶，RNase）广泛存在、活性稳定，其反应也不需要辅助因子，因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就难以获得完整的RNA；而所制备的RNA的纯度和完整性又直接影响着RNA分析的结果，长度大于4 kb的转录本身存在的概率更小，其对于痕量RNase的降解也比小转录本更敏感，所以RNA的制备与分析操作难度极大，克隆长片段的基因更是一门艺术。总之，在所有RNA实验中，归根结底就是防止RNA酶的污染，分离到全长的RNA。

近年来，常用的RNA酶抑制剂主要有：①异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是目前被认为最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。②焦碳酸二乙酯（DEPC）。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。DEPC通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，使用浓度为0.05%～0.1%。③钒氧核糖核苷复合物。由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，因而能百分之百地抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10 mmol/L。④RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）。是一种从大鼠肝或人胎盘中分离出来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。本实验采用DEPC对实验中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等进行处理。

总RNA制备的方法很多，如：①异硫氰酸胍－苯酚法，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒（如Trizol试剂盒，其实质也是异硫氰酸胍－苯酚法），从而可快速有效地提取到高质量的总RNA。②超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。③其他一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其他杂质以后，将纯净的RNA洗脱下来，这样就可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。

目前，最常用的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。异硫氰酸胍－苯酚法的基本过程是：先将样品（以动物的腺体或组织为例）放进匀浆器中加入异硫氰酸胍变性液进行匀浆裂解，再用酸性苯酚（水饱和酚）、氯仿抽提除去DNA和变性的蛋白质，最后用异丙醇沉淀出RNA。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA，酸性条件使RNA与DNA分离，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。其纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。Trizol试剂法进一步提高了RNA的提取能力，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。该法甚至可以从最少100个细胞或1 mg组织中提取RNA。本实验就简单介绍Trizol Reagent（Total RNA Isolation Reagent）的使用方法。不同公司的RNA提取试剂盒具体的使用方法略有不同，可参照产品使用说明书。

实验用品

1.材料

斑马鱼胚胎或器官组织。

2.器材

体视显微镜，照相机，1 mL注射器，分光光度计，微量移液枪。

3.试剂

Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC-H2O配制）、DEPC处理后的蒸馏水。

实验程序

1.总RNA的提取

（1）样品处理：斑马鱼整体胚胎提取时，收集30个胚胎。提取成鱼组织中的总RNA时，在体视显微镜下摘出2～5尾斑马鱼相关组织（如卵巢、精巢、心脏、肠等组织），合并置于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，用1 mL注射器抽动管中液体，使胚胎或组织充分破碎。

（2）RNA层分离：冰上放置5 min，加入200 μL的氯仿，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清。

（3）沉淀：加入200 μL异丙醇，冰上放置10 min，4℃12 000 r/min离心15 min。

（4）洗净：弃去上清液，加入1 mL的75%乙醇（DEPC-H2O配制）洗涤，4℃下12 000 r/min离心5 min。(www.daowen.com)

（5）干燥与溶解：弃去上清液，干燥15 min，然后将RNA溶于50 μL DEPC-H2O中。取3 μL总RNA于1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

（6）浓度测定：RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260 nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1，相当于大约40 μg/mL的单链RNA。用DEPC-H2O稀释RNA样品n倍并以DEPC-H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（μg/mL）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值过高，则提示RNA有降解。

2.cDNA的制备

First-strand cDNA合成反应液体系为20 μL时需总RNA 10 pg至5 μg或mRNA 10 pg至500 ng。引物oligo(dT)20(20 μmol/L)1 μL(也可使用随机引物50～250 ng或基因特异引物2 pmol)。

（1）反应液（1 μg/μL总RNA，使用20 μmol/L oligo(dT)20）。

（2）65℃，5 min。加热后立即放入冰盒中急剧冷却1 min以上。

（3）向反应液中加入以下试剂（放入后使用移液枪反复抽吸混合）。

（4）37℃，1 h。

（5）70℃，10 min。

实验注意事项

1.最大限度地抑制内源性的RNA酶。因为各种组织和细胞中含有大量内源性的RNA酶，所以所有分离提取RNA的方案都是在能导致RNA酶变性或失活的化学环境中使RNA释放出来。

2.严格控制外源性RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液中，也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。因而为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特别处理。

思考题与作业

1.给出提取的总RNA的浓度测定结果。

2.在提取RNA过程中应注意哪些事项？

参考文献

谢保胜，藤原滋树.斑马鱼总RNA提取和纯化[J].生物学杂志,2007,24(6)：67-69.

董武.斑马鱼及相关实验技术[M].青岛：中国海洋大学出版社,2006.

（李建真）