实验目的

了解斑马鱼的早期发育过程。掌握斑马鱼不同胚胎发育时期的特点。

实验原理

斑马鱼胚胎发育的最重要的特点之一是迅速。斑马鱼的胚胎发育既有普通硬骨鱼胚胎发育的一般特点，即经过受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、三胚层分化及出膜等时期,也有其自身的独特之处。斑马鱼受精卵为典型的非黏性沉性卵，由于卵外胶膜吸水膨胀，受精卵可在水中漂流；斑马鱼的胚胎发育从受精卵到幼鱼出膜整个过程均在胶膜中进行；受精卵在受精后10 min释出第二极体。斑马鱼的卵属端黄卵，其卵裂为不完全的盘状卵裂，最初4次卵裂形成的卵裂球在细胞的基部与卵黄间有间桥相连，第5次卵裂后只有胚盘边缘的细胞通过细胞质间桥与卵黄细胞质层相连，而其他硬骨鱼是上、下层分裂球中只有下层分裂球与卵黄细胞质层相连。

斑马鱼的受精卵为圆形，属沉性卵，直径约1 mm，沉于水底。受精45 min后开始卵裂，以后每15 min左右卵裂1次，随着卵裂的进行，卵裂球数渐多，体积渐小，细胞界限渐变模糊。2.5 h后胚胎发育进入囊胚期，可见胚盘像一顶帽子盖在卵黄的表面。8 h左右胚盘下包，原肠期开始，卵黄沉于胚盘下。胚盘下包1/2左右时，胚盘像一顶卷边帽子包被在卵黄的顶面，卷边即是胚环。此后，在胚盘一侧细胞层加厚形成胚盾，这时胚盘为很薄一层贴在卵黄表面。15 h后，胚胎开始出现体节、眼基、枯氏囊泡（kupffer's vesicle）等器官原基的分化，并逐渐发育为幼鱼。出膜前的幼鱼头尾相对曲卧于胶膜中，腹侧“抱着”卵黄，其眼球黑色，背腹部黑色素细胞呈斑块状，心脏为似纺锤形的囊，节律性心跳明显，血液由心脏泵出，通过耳囊深部沿背血管流向体后，然后折转向前腹部，向前穿过卵黄流回心脏。消化道、泄殖孔清晰可见，尾鳍宽大，耳囊呈薄膜状，内可见两个黑色小圆点。此时，若小心剥膜，鱼体则伸直，并能快速在水中游动。3 d后，正常发育的幼鱼尾部剧烈摆动破膜先出，之后整个鱼体出膜。出膜的幼鱼体长约4 mm，并侧卧于水底，受到刺激或惊动迅速游走。出膜0.5 d，幼鱼正卧于水底，1 d后常到水面游动，1周后开始捕食。

实验用品

1.材料

斑马鱼受精卵。

2.器材

体视显微镜，照相机。

3.试剂

胚胎培养液使用E3培养液：5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4，用水补至终体积。

实验程序

通过自然受精法或人工授精法获得斑马鱼受精卵。将受精卵置于胚胎培养液中28℃培养。胚胎发育过程在实体显微镜下进行连续观察：先在低倍镜下观察，再转高倍镜观察下列各期。斑马鱼的胚胎发育时期（stages of embryonic development）。根据Kimmel等的经典分期法，可以将斑马鱼的胚胎发育大致分为七个时期。镜检下可完整观察到以下胚胎的发育形态（附图片均摘自于斑马鱼专业网站http：//zfin.org）。

1.受精卵（Zygote）

斑马鱼受精卵外有较厚的透明胶膜，受精卵内密布有卵黄颗粒。受精后10 min受精卵近动物极端出现一片状突起，突起基部出现一分裂沟，以后突起消失。该突起是受精卵完成第二次成熟分裂后释出的第二极体。30 min后受精卵动物极端向外膨出形成一明显的亮区，即胚盘（Kimmel et al.,1995）（附图8-1）。

附图8-1　斑马鱼合子期胚胎示意附图

2.卵裂期（Cleavage period）

斑马鱼的早期卵裂速度很快，每个卵裂周期仅需15 min左右。早期卵裂是在母性物质驱动下通过有丝分裂传递给所有细胞的。卵裂球数目虽增加,但胚胎体积未增，细胞没有生长期，因此，细胞周期短，卵裂速度快，细胞分裂也几乎同步。前6次卵裂均为明显的由动物极向植物极方向进行的径裂，其奇数卵裂面、偶数卵裂面各相平行，且奇数卵裂面与偶数卵裂面相互垂直（见表8-1）。随着卵裂的进行,卵裂球愈来愈小,规则地排列于胚盘表面，并渐向胚盘外表面推移，但细胞界限仍能分辨（Kimmel et al.,1995）（附图8-2）。

表8-1　斑马鱼卵裂特点

附图8-2　斑马鱼卵裂期胚胎示意附图

3.囊胚期（Blastula period）

从第8次卵裂开始，进入囊胚期，形成盘状囊胚，但与其他真骨鱼类不同的是，在斑马鱼的囊胚期，不形成囊胚腔，只有在胚盘的下层细胞中，形成一些小的细胞外间隙，此时，在胚盘和卵黄之间，还形成一薄层无细胞界限的细胞质，内含许多细胞核，称为卵黄多核体（yolk syncytial layer,YSL）。同时，细胞分裂的周期开始延长，这标志着中囊胚转换（midblastula transition,MBT）开始。随着细胞分裂的继续，胚盘变扁平，胚层延伸并扩展到卵黄球上。从MBT开始，细胞周期的延长并非同时发生在所有细胞，不同细胞的周期长度逐步呈现差异。第9次卵裂时，各个细胞的周期仅有微小差异；到第12次卵裂时，胚胎某些细胞的周期已经延长了2倍以上（Kimmel et al.,1995）（附图8-3）。

附图8-3　斑马鱼囊胚期胚胎示意附图

到囊胚晚期，囊胚表面细胞向卵黄部分下包，胚盘变成弓状，卵黄合胞体层变为钟形或圆顶形，预示原肠作用将开始。胚盘细胞分为三群：胚盘最表面为一层扁平的包被层细胞，细胞排列较紧密；卵黄之上胚盘之下为卵黄合胞体层,为多核无质膜分隔的细胞融合体；包被层边缘与卵黄合胞体层紧密相连，二者间疏松的细胞群即深层细胞，各细胞中染色体清晰，并可见细胞有丝分裂相。

斑马鱼从第10次卵裂（512细胞囊胚期）开始进入中囊胚转换，细胞分裂速度减慢，合子基因开始表达，细胞明显开始移动。转录和细胞迁移是在MBT阶段开始发生的，同样也是MBT阶段的关键特征。中囊胚过渡是胚胎由母型调控全面进入到合子型调控的重要阶段，大规模转录活动的发生、细胞周期形态改变以及细胞运动能力的出现都标志着胚胎进入了自主调控的发育状态，而这种状态理应是中囊胚过渡前的卵裂阶段的不同来源的诸因子相互协调作用的结果。

4.原肠胚期（Gastrula period）(www.daowen.com)

鱼类胚胎中最早的细胞运动是胚盘细胞沿卵黄四周下包。初始阶段，胚盘内层细胞向外周迁移，插入表层细胞中。稍后，表层细胞沿卵黄表面下包，直到将卵黄全部包起来。沿卵黄表面下包的表面细胞层称为包被层（enveloping layer,EVL）。包被层细胞的下包运动，并非由分裂球主动移动引起，而是由卵黄合胞体层自动扩展引起的。卵黄合胞体层是位于胚盘下面卵黄表面含有多个细胞核的一层细胞质层。包被层和卵黄合胞体层紧密相连，卵黄合胞体层的自动扩展必然拉动与之相连的包被层细胞向下移动。随着下包运动的进行，卵黄合胞体层和包被层之间产生的空隙由胚盘深层细胞所填充。卵黄合胞体层的扩展拉动包被层细胞向下运动这一点可以通过切断卵黄合胞体层和包被层两者之间的联系来证明。当卵黄合胞体层和包被层两者之间的联系被切断后，盘细胞会反弹缩回到卵黄顶部，而卵黄合胞体层则继续包绕卵黄扩展。卵黄合胞体层的扩展受其中的微管系统控制，用辐射或药物处理阻断微管聚合就能抑制下包。

胚盘细胞下包至卵黄1/2处时,整个囊胚边缘处形成略厚的胚环，其上层细胞为上胚层（epilblast），下层细胞为下胚层（hypoblast），上胚层将来分化为斑马鱼的外胚层，而下胚层分化为中胚层和内胚层。上胚层和下胚层的卷边形成增厚的环形生殖环（germ ring），在生殖环的局部某处，由于细胞的集中内卷运动，出现一加厚隆起，称为胚盾（embryo shield）。胚盘较薄盖在卵黄的一侧，单个细胞数增多，细胞体积较小，表层细胞仍为扁平状，深层细胞分散存在，细胞核较大（Kimmel et al.,1995）（附图8-4）。上、下胚层细胞向将来发育为胚胎背部的一侧集中和伸展形成加厚的胚盾，胚盾的下胚层细胞向背中线集中，并沿背中线向前延伸，形成脊索中胚层，其相邻的近轴细胞形成中胚层体节原基。位于上胚层的预定脑细胞也向背中线集中，形成神经龙骨，而其余的上胚层细胞将发育为鱼的皮肤。

附图8-4　斑马鱼原肠胚期胚胎示意附图

5.体节期（Segmentation period）

体节期也称作尾芽期，在该时期尾芽出现在长轴的尾端。有多种形态运动出现，最显著的特征是近轴中胚层节律性分节从而形成体节，可以观察到一些器官的初步形成。这一时期主要有5个阶段（Kimmel et al.,1995）（附图8-5）：1-somties stage（），14-somties stage（16 h），20-somties stage（19 h），26-somties stage（22 h）。1-somties时期形成第一个体节沟，在外包完成和尾芽开始出现以后，并不是不可变。这个体节沟在第一个体节和第二个体节之间。之后会以每小时3个体节的速度发育体节。体节期发育完成时，胚胎包括8000～10 000个细胞；眼原基和耳原基开始出现；脑神经外胚层（neuroectoderm）变厚，在18-somties时期，脑的），5-somties stage（分节特别明显；脊索（notochord）细胞开始扩展并延伸到胚胎尾部；随着肌隔膜（myoseptum）的形成，体节呈现出交叉缝式。

附图8-5　斑马鱼体节期胚胎示意附图

6.咽囊期（Pharyngula period）

咽囊期体轴从早期的弯曲变为伸直；循环、色素细胞开始分化，同时鳍条开始发育。这一时期分4个明显的发育阶段（Kimmel et al.1995）（附图8-6）：prim-5 stage（24 h）；prim-15 stage（30 h）；prim-25 stage（36 h）；high-pec stage（42 h）。prim-5 stage，在视网膜和皮肤上出现色素，卵黄中有血细胞，心脏开始搏动。prim-15时期，微循环开始，出现胸鳍芽，尾部逐渐伸直。之后伴随着明显的血液循环，色素沉积，内脏发育。在这一时期能够从胚胎形态上区分斑马鱼和其他脊椎动物，包括有一个发育良好的脊索；延伸的后尾，其神经系统中空并向前扩展。这一时期最引人注意的发育事件是咽弓原基的出现。此外还具有显著的行为发育，出现了触觉灵敏性。

7.孵化期（Hatching period）

孵化期胚胎与以前具有相同的生长速率，完成了基本器官系统的快速形态发生；脑和胸鳍的软骨发育；表现出孵化不同步性；在72 h，鱼鳔膨胀；开始觅食，具有主动避敌行为（Kimmel et al.,1995）（附图8-7）。

实验注意事项

1.早期胚胎发育对温度要求较高，温度较低会导致胚胎发育延迟甚至死亡。

2.每天需要更换胚胎培养液一次，将发育畸形或已经死亡的胚胎及时剔除，以避免污染培养液。

附图8-6　斑马鱼咽囊期胚胎示意附图

附图8-7　斑马鱼孵化期胚胎示意附图

思考题与作业

1.用相机拍摄或手绘不同发育时期（至少6个主要时期）斑马鱼胚胎的形态，并简要说明该时期特点。

2.斑马鱼的早期发育和其他几种脊椎动物（鸡、小鼠和爪蟾）的胚胎发育相比，有哪些特点。

参考文献

Charles B.Kimmel,William W.Ballard,Seth R.Kimme,et al.Stages of embryonic development of the zebrafish[J].Developmental Dynamics,1995,203(3)：253-310.

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曲漱惠,李嘉泳,黄浙,等.动物胚胎学[M].北京：人民教育出版社,1980.

柳爱莲,曹更生.斑马鱼早期胚胎发育形态学观察[J].河南大学学报(自然科学版),2004(2)：53-56.

于学慧,张世栋,张承海.发育生物学的理想动物模型——斑马鱼[J].中国实验动物研究杂志,2001,11(3)：172-175.

（李建真）