实验目的

了解斑马鱼产卵过程，掌握收集斑马鱼受精卵的方法。

实验原理

斑马鱼又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼，属鲤科短担尼鱼属，孵出后约3个月可达性成熟。成熟的雌鱼每隔一周可产几百粒卵子，其受精卵为圆形，属沉性卵，直径约1 mm，沉于水底。卵子体外受精、发育，胚胎发育同步，且速度快，在25～31℃之间生长发育。成年斑马鱼能承受高密度饲养——每升水中最多可容纳5尾，意味着容易饲养大量群体，管理饲养易行。每条雌性斑马鱼每周可产生大量卵子（＞200枚），胎间距短，为3个月。斑马鱼的受精及发育都在母体外进行，因此容易进行观察和操作，如进行组织移植或化学药物刺激等。斑马鱼作为发育生物学理想的模式生物之一，如何正确饲养斑马鱼以及顺利获得其受精卵，是进行斑马鱼发育研究的实验室需要具备的最基本条件。

实验用品

1.材料

成体斑马鱼，纱布，移液枪，直径9cm的培养皿。

2.器材

体视显微镜。

3.试剂

（1）Hank’s溶液；将系列储液按顺序混合而成，10 mL储液#1、1 mL储液#2、1 mL储液#3、86 mL双蒸水、1 mL储液#4和1 mL储液#5，需要新鲜配制。

（2）储液#1：8.0 g NaCl，0.4 g KCl，溶于100 mL双蒸水。

（3）储液#2：0.358 g Na2HPO4（无结晶水），0.60 g KH2PO4，溶于100 mL双蒸水。

（4）储液#3：0.72 g CaCl2，溶于50 mL双蒸水。

（5）储液#4：1.23 g MgSO4·7H2O，溶于50 mL双蒸水。

（6）储液#5：0.35 g NaHCO3，溶于10 mL双蒸水。

室内循环水人工养殖。

实验程序

1.自然受精法

斑马鱼在繁殖时通过光周期作用，在日出后产卵。为了每天能稳定地获得部分斑马鱼胚胎，可以在水族箱中放入等量的雌鱼和雄鱼，控制光周期为14∶10（即光照14 h，黑暗10 h），每天投喂优质活饵料，并在水族箱底部放置鱼卵收集框，卵产出后落入框中的缝隙，以防止鱼将所产卵吃掉。这样每天清晨可从水族箱中吸出受精卵，另行孵化。如不想进行繁殖，可移去收集框，并减少投喂量，否则鱼容易肥胖而影响其繁殖。具体方法如下：

（1）放置鱼卵收集框。可在投喂饵料至少30 min后进行，以给鱼足够的时间吃光所有饵料。在鱼停止摄食后，放入收集框，框中可放置水草以吸引斑马鱼在框中产卵。(www.daowen.com)

（2）受精卵收集。次日清晨光照后，可看到雌雄鱼的追尾现象。观察到雌鱼产卵后，小心取出收集框，待所有受精卵沉到底部后，倒出液体，将受精卵转入培养皿中，用胚胎培养液清洗数次，用镊子清除粪便等污物，即可进行孵化。

（3）受精卵的处理。吸出的受精卵中可能混有大量的杂质和污物，包括成鱼的粪便、破碎的卵粒、饵料等。由于斑马鱼的卵密度较大，可以冲入胚胎培养液进行清洗，然后用吸管在显微镜下剔除发育不良的胚胎。清洗和培养过程要注意水温的变化。

2.人工授精法

斑马鱼一般10～12周达到性成熟，但7～18月龄的斑马鱼人工授精较好。首先用雌雄鱼分别饲养，每个40 L左右的水族箱中放养雌鱼8尾或雄鱼16尾，每天投喂优质活饵料2～3次，并换水1/3，培育6～7 d。具体方法如下：

（1）在实验前一天下午准备实验用鱼，取用腹部饱胀、饱满的雌鱼，活动力较强的雄鱼。实验用鱼还应确保在一个月以上没进行过人工授精。雌雄鱼分开饲养。

（2）次日清晨雌雄鱼从水族箱中捞出，放置于小容器中，以便之后捞取。

（3）收集精液。捞出雄鱼，用纱布轻轻包住鱼体，轻轻挤压雄鱼腹部，当有乳状精液从泄殖孔中流出，即将鱼体下半部浸入盛有Hank’s液的培养皿中，稍稍再挤压其腹部。整个操作过程要迅速和小心，以避免对鱼体的损伤。连续收集数尾雄鱼精液。

（4）人工授精。捞出雌鱼，用纱布轻轻包住鱼体，挤压其腹部，如雌鱼发育良好，可轻易将卵挤出，将卵挤入盛有精液的培养皿，之后轻轻晃动培养皿，使精卵充分混合。质量较好的卵子为淡黄色，透明状良好，如发现有较多的白色或呈不透明状，说明卵子质量较差。

根据雌鱼成熟情况不同等因素，可能会出现以下情况：卵质量较好（淡黄色，半透明，饱满）；坏卵（卵发白，甚至部分卵已经破裂）；部分好卵（卵中有部分卵为坏卵）；没有卵。达到成熟的卵，如不能产出，则被雌鱼吸收。如果卵子质量较好，但受精率较差，可能因为精子活性较差。

实验注意事项

1.不论自然受精法和人工授精法成功率，除了取决于实验中的操作，更重要的是都取决于鱼的质量。

2.在人工授精中，操作一定要轻柔，以避免对鱼体的损伤。

思考题与作业

1.自然受精法和人工授精法有哪些区别？

2.试述你所熟悉或了解的几种鱼的生殖特点。

参考文献

Westerfield M.The zebrafish book[M].Eugene，ore：university of Oregon Press，1995.

董武.斑马鱼及相关实验技术[M].青岛：中国海洋大学出版社,2006.

（李建真）