实验目的

掌握斑马鱼饲养方法。

实验原理

斑马鱼（Danio rerio，旧称Brachydanio rerio），俗称“zebrafish”，或“zebra fish”，属硬骨鱼，辐鳍纲（Actinopterygii），鲤形目（Cyprinidae），鲐属（Danio）。原产于印度，为一种性情温和、杂食性的淡水鱼。斑马鱼常见的有10余个品系，主要区别在色彩和斑纹，色彩艳丽多样，斑纹有多有少、有宽有窄，有的则呈点状；也有的品系在鳍形上产生变异，如长鳍斑马鱼，其尾鳍、臀鳍、腹鳍又宽又长，似一簇黄色的尼龙绸在身后飘荡。目前研究中常用的有源于德国的Tubingen和源于美国的AB两个品系。

斑马鱼成体呈梭形，长5 cm左右，胸腹部较圆，尾部侧扁，全身淡黄色，背部橄榄色，从背部至腹部、臀鳍有多条深蓝色横向条纹直达尾鳍，满身条纹似斑马而得名；背鳍、臀鳍偏后，尾鳍深叉形，诸鳍均淡黄色透明。成体雌鱼为银灰色，体态丰满，腹部膨大；成体雄鱼为柠檬色，身体修长，腹部扁平。

斑马鱼容易大规模饲养，3个月可达性成熟。雌鱼可每周产卵一次，每次几百枚卵。斑马鱼的胚胎发育是在体外完成的，并且透明可见，这不仅使研究人员很容易得到胚胎，而且还能在显微镜下直接观察其胚胎发育的过程。由于胚胎易得、便于体外观察等优点，斑马鱼成了一种越来越受欢迎的模式脊椎动物。

对斑马鱼的研究已全面展开，目前对其饲养的标准也逐渐在建立。斑马鱼原产于亚洲南部，广泛分布于印度、孟加拉国、尼泊尔、缅甸以及巴基斯坦。这些分布地区大多是季风气候，有明显的降雨和干旱季节，能有效影响斑马鱼栖息地的参数包括水化学和资源系数等。有报道称斑马鱼能适应各种各样的环境生存，包括水渠、水稻农田、人工鱼池、河流上游甚至快速流动的溪流中都生活有斑马鱼。在2006年，于印度和孟加拉国开展的两次针对斑马鱼野生生境的调查中发现，斑马鱼有着广泛的分布范围和生境。有趣的是，在发现斑马鱼的大部分或者全部区域都与水生植物有关。所有研究也表明，在发现斑马鱼水体其物理和化学特性也会影响到斑马鱼的分布，包括水体pH、温度、盐度、透明度、深度以及消光系数。目前实验室斑马鱼饲养条件都基于野外调查所得。

实验用品

1.材料：丰年虾，海盐，成体斑马鱼，幼体斑马鱼。

2.器材：鱼缸。

3.试剂：室内循环水人工养殖（养殖系统为公司直接安装的全自动水循环系统）。

实验程序

1.成鱼喂养

（1）鱼房和鱼柜

斑马鱼的适宜生长温度为28.5℃。为了保持温度，最好有专用的恒温鱼房，或者将鱼柜放置在专用房间内。可使用暖气、空调、电暖气等调整温度。为了使斑马鱼有规律地产卵，其喂养需要严格的光周期控制。最好能在鱼房内用自动计时器保持14 h光照/10 h黑暗交替循环。每10 L的鱼缸所养成鱼数量最好不要超过10条。平时雌鱼与雄鱼可以混养，也可分开饲养。

（2）斑马鱼培养用水和溶液

养鱼系统需保持日夜循环水，每天另需补充10%新鲜的去离子水。水的盐度使用NaCl调节保持在450～500 μs/cm之间，pH使用NaHCO3调节，保持在7左右。

对于胚胎和幼鱼，可使用系统循环水喂养，也可使用各种培养液等培养，以保持电解质平衡。最常用的培养液为Holtfreiter Buffer（简称Holt Buffer），此外还有E3培养液、Hank’s溶液等。

（3）虾卵孵化

丰年虾（Artemia salina），又称丰年虫、卤虫。隶属于节肢动物门，甲壳纲，鳃足亚纲，无甲目，丰年虫科。丰年虾广泛分布于陆地上的盐田或盐湖中，对于人工养殖的鱼虾，营养价值非常高。丰年虾的冬卵，更是一种很特别的休眠卵，可以晒干装罐，以商品形式上架销售，并且可以很方便地孵化出来，作为优质活饵料，丰年虾在水产养殖上应用甚广。需要孵化时，通常以1 L纯净水添加34 g NaCl和3.5 g丰年虾卵的比例混合，在28℃充分通氧气孵化27～30 h。收集孵化的虾卵时先移去氧气管，沉淀10 min，此时未孵化下卵和已孵化的虾都将沉淀于孵化器底部，虾壳则漂浮在液面上。打开底部的出水阀，让沉淀流出，下面接筛网，用筛网富集沉淀的小虾。注意不要将虾壳一起漏出。用较细水流的纯净水轻轻冲洗1 min，以过滤掉大部分盐分。最后将小虾置于烧杯中，立即投喂。

注意：孵化出的丰年虾为淡红色，未孵化出的虾卵呈灰色沉淀在烧杯底部，可用吸管吸出弃去。孵化出的丰年虾若不能及时投喂，应用保鲜膜包裹置于4℃保存备用，或置于室温通气暂存。如果检查发现死虾过多成絮状，应抛弃重新取新鲜孵化的喂养。

（4）喂鱼(www.daowen.com)

新鲜孵化的丰年虾是斑马鱼最好的饲料（附图6-1）。一般每日喂3次，三餐时间最好控制在上午8时左右、中午12时左右和下午5时左右。因此，需要有多批丰年虾处于不同孵化阶段。投喂前停止循环水，每个10 L缸投喂成活的丰年虾3 mL左右。若鱼处于快速生长期可适量多喂。丰年虾最好达到95%以上的成活率，并且具有较大的密度。充足的食物供给可以保证斑马鱼产卵的质量与数量。投喂后经半小时左右待鱼充分进食后再开启循环水。

在特殊情况丰年虾暂时无法获得的情况下，可使用市场上出售的金鱼食临时喂养，但须注意根据鱼食的具体情况适当投料、及时清理残渣，避免污染系统。

附图6-1　丰年虾显微放大照片

（摘自www.hudong.com）

2.幼鱼喂养

（1）草履虫培育

接种：在2000 mL洗净灭菌的大烧杯中装约1800 mL纯净水，高压灭菌。加入10～15粒麦粒（需事先灭菌），1粒酵母片（最好使用不含糖的制品），接种200 mL长势较好、密度较大的草履虫母液。使用灭菌的牛皮纸盖上，28℃恒温静置培养1周左右。在显微镜下观察，选择密度大且没有其他浮游动物的草履虫投喂。约用至30 d后需重新接种草履虫。草履虫密度适中时，通常每10条幼鱼每天喂15 mL草履虫即可。

（2）幼鱼喂养与入柜

胚胎和幼鱼每天喂食草履虫2～3次，每次喂食之前换养鱼水1次。然后按照约5 mL草履虫/10条小鱼的量投喂。草履虫使用前需用细网过滤掉杂质，需要多少过滤多少，未使用完的草履虫不可混回原缸，以防止污染。

幼鱼自胚胎发育12 d起可开始用草履虫和丰年虾混合喂养。每次投喂1 h后将底部的死虾洗出，否则会影响水质。待幼鱼可全部吃虾时（能吃虾的幼鱼腹部呈红色），可转入鱼房，跟成鱼一起统一喂养。注意鱼缸后的滤网或挡板应随幼鱼的生长而及时选择适当的孔径进行更换。

实验注意事项

1.斑马鱼饲养过程中对光周期，饲喂的饵料量以及温度要求较高，需尽量按照标准流程进行。

2.丰年虾的孵化过程中需要严格控制时间，避免将还未孵化出的丰年虾卵饲喂斑马鱼，这样会造成斑马鱼消化不良，甚至会导致小鱼死亡。

思考题与作业

根据实验中的讲解，描述如何区分雌雄斑马鱼。

参考文献

Christian L.The husbandry of zebrafish(Danio rerio)：A review[J].Aquaculture,2007,269：1-20.

董武.斑马鱼及相关实验技术[M].青岛：中国海洋大学出版社,2006.

（李建真）