实验目的

1.了解线虫显微注射基本操作过程。

2.加深对转基因技术的理解。

实验原理

显微注射是构建转基因动物常用的技术手段，它的目的是将外源DNA在活体动物中表达并遗传给后代。转基因线虫因其操作方法较为简便且构建周期短，已经成为基因功能研究中常用到的基础材料。

外源DNA显微注射线虫的部位是它的性腺（gonad），线虫性腺呈U字形，卵细胞在性腺中移动并不断成熟，经过储精囊（spermatheca）后受精进入胚胎发育时期，之后由产卵器（vulva）排卵（附图4-1）。U型性腺起始端的性腺臂处是分化程度很低的卵原细胞，在此处进行显微注射可将外源基因导入线虫中表达（附图4-2）。

附图4-1　线虫生殖系统

（来自http：//celldiv.com/content/1/1/6/figμre/F2?highres=y）

附图4-2　显微注射部位示意附图

（来自http：//www.wormbook.org/chapters/www_transformationmicroinjection/transformationmicroinjection.html)

本实验拟注射质粒myo-2：：GFP，myo-2是线虫中咽部肌肉肌球蛋白重链基因，用此基因的驱动子（promoter）驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达可以标记线虫的咽部肌肉。在注射过质粒的线虫后代中若发现有咽部肌肉发绿色荧光的线虫说明转基因成功。

实验用品

1.材料

线虫（成年早期为佳），质粒（本实验用myo-2：：GFP质粒，是用线虫的实验室最常用的marker质粒）。注射玻璃针：采用高温拉制的玻璃微电极，注射针的拉制非常重要，尖端一定不能太粗，直径约5 μm。

2.器材

显微注射仪、体视荧光显微镜、注射用玻璃针（由电极拉制仪拉制）、粘虫用琼脂板、挑虫用铂针、撞针板、线虫培养板。

3.试剂

卤代烃油（Halocarbon Oil Series HC-700），线虫生理盐水（M9 buffer）。

M9 buffer配方：5.8 g Na2HPO4；3 g KH2PO4；0.5 g NaCl；1 g NH4Cl，加入蒸馏水至1 L，高压灭菌后可使用。M9 buffer是线虫的生理盐水，用于注射后恢复线虫使用。

实验程序

1.注射前准备

琼脂糖粘虫板：滴一滴加热溶解的2%琼脂糖溶液在载玻片上，用另一载玻片轻压其上，待琼脂糖凝固后，将上面的玻片从侧面滑下即可。制作好的粘虫板37℃过夜或65℃干燥1 h后可使用。

2.灌针（将待注射的DNA混合液灌入注射针）(www.daowen.com)

本实验使用质粒小抽试剂盒抽提的myo2：：GFP质粒,注射前将注射液从针尾部灌入，等待数分钟，观察针尖无气泡即可装上注射仪。

3.撞针

由于拉制好的玻璃电极尖端是封闭的，故需将其尖端撞开小口。撞针前需制作撞针板。一般可用两片洁净的盖玻片用乙醇清洗后叠放在一起，中间加上卤代烃油，玻璃针架在注射仪上浸在油里，操作微调使注射针与玻片边缘相撞，若针头尖端撞破，可观察到有液泡自动渗出。

4.线虫固定

选即将产卵或体内有少量卵的年轻成虫进行注射，因为这个时期性腺发育成熟，较易被转基因。注射时将线虫挑至琼脂糖粘虫板上，调整线虫使性腺暴露，滴加注射油覆盖整个虫体。也可以先加注射油然后将线虫浸在油里固定。固定好后操作要迅速，否则线虫容易脱水死亡。一般在20倍镜下撞针，撞针后渗出的液泡不要太大，否则针尖太粗。

5.注射

将固定好虫子的粘虫板放在载物台上，40倍物镜下找到线虫，调整焦距，操作微调或轻移滑动载物台，将注射针尖刺入性腺。启动微量加压器进行注射，能观察到注射液在性腺中扩散。若发现液体流速很快，此时很有可能注射进入肠道。

6.注射后线虫恢复

在体视显微镜下，滴加M9 buffer至注射后的线虫正上方，由于油水不相溶，缓冲液会渗入油下使线虫浮起。等待约2 min，使线虫活力恢复，即头部左右摇摆，身体开始游动，此时即可挑至培养板上，20℃恒温培养。每个培养板上放注射后的线虫不要太多，一般每板4只。

7.观察子一代（F1）

注射后约3 d，可在体式荧光显微镜下观察荧光表达情况，成功表达的线虫咽部会有GFP绿色荧光（附图4-3）。

附图4-3　成功表达有myo2：：GFP荧光的转基因线虫

实验注意事项

1.线虫固定好后操作要迅速，否则线虫容易脱水死亡。一般在20倍镜下撞针，撞针后渗出的液泡不要太大，否则针尖太粗。

2.显微注射时若发现液体流速很快，此时很有可能注射进入肠道。

思考题与作业

1.请预计myo2：：GFP转基因线虫子一代，子二代中荧光表达情况，外转的基因会一直稳定传代吗？

2.某同学想知道基因A在线虫中的表达模式，他将做成的质粒A：：GFP注射线虫，结果在F1代中未找到表达GFP荧光的线虫，请帮助该同学找到本次实验失败的原因并制定下一步实验方案。

参考文献

酒亚明,张蓉颖,吴政星.线虫基因显微注射和整合技术——设备、操作与指南[J].生物化学和生物物理进展,2009,36(5)：648-652.

Hope I A.C.elegans：a practical approach[M].London：Oxford university Press,1999.

（李凯，李巧峡）